張東雪，高少輝，李同妙，周薇

血管鈣化是導(dǎo)致心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）發(fā)病率與死亡率升高的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和獨(dú)立危險因素［1］。血管鈣化不是一個被動的過程，而是由細(xì)胞介導(dǎo)的高度可調(diào)的過程［2］，其重要機(jī)制是血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的成骨樣表型轉(zhuǎn)化。賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SET8是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)唯一能夠特異性單甲基化組蛋白H4賴氨酸第 20位賴氨酸（histone H4 lysine 20，H4K20）的甲基轉(zhuǎn)移酶，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)移與分化等［3］。SET8 還可甲基化 TWIST、Wnt、P53等非組蛋白［4］，并通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程影響相應(yīng)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與分化等。也有研究表明活化的Wnt信號通路可通過上調(diào)RUNX2的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)血管鈣化［5］。但SET8在VSMCs轉(zhuǎn)分化中的作用尚少見相關(guān)研究。為此，本研究以大鼠VSMCs為模型，觀察SET8對大鼠VSMCs向成骨樣細(xì)胞分化的影響。

Tab.1 Primer sequence of each purpose gene表1 各目的基因引物序列

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 由河北醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供的清潔級健康雄性SD大鼠8只（合格證編號：1305090），均為4周齡，體質(zhì)量 80～120 g，平均體質(zhì)量（95.7±6.5）g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 胎牛血清（fetal bovineserum，F(xiàn)BS）和DMEM（dulbecco’s modified eagle’s medium）培養(yǎng)基由美國GIBCO公司提供，SET8-短發(fā)夾RNA（shRNA）質(zhì)粒及空質(zhì)粒（NS-shRNA，廣州復(fù)能基因有限公司），LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），堿性磷酸酶（ALP）活性試劑盒（中國Njjcbio公司），反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（美國Thermo公司），PCR引物（上海捷瑞生物工程有限公司），RUNX2抗體和SET8抗體（英國Abcam公司），GAPDH抗體（美國Bioworld公司）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Sheldon公司），RT-PCR儀（美國Abi公司），倒置相差熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司），酶標(biāo)儀（美國Biotek公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Proteinsimple公司），蛋白電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽渑c分組 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)原代大鼠胸主動脈VSMCs，具體操作為：采用2%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，75%乙醇浸泡，于生物安全柜中分離出胸主動脈，剝除內(nèi)外膜，將中膜剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，均勻鋪滿瓶底，加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后更換新鮮培養(yǎng)基。之后每隔2 d換液，細(xì)胞融合80%～90%時進(jìn)行傳代。細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第3～4代時用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種于適宜孔板中，融合率達(dá)80%時給予轉(zhuǎn)染干預(yù)。轉(zhuǎn)染方法為：參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組為：（1）正常對照組：未轉(zhuǎn)染組。（2）空質(zhì)粒組：NS-shRNA質(zhì)粒濃度為2μg/L、Lipo2000 為 4 μL/孔，轉(zhuǎn)染 VSMCs。（3）SET8-shRNA 組：SET8-shRNA 質(zhì)粒濃度為 2μg/L、Lipo2000為 4μL/孔，轉(zhuǎn)染VSMCs。

1.4 RT-PCR測定VSMCs內(nèi)SET8、RUNX2 mRNA的表達(dá)水平 采用RNA提取試劑提取轉(zhuǎn)染后3組的mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。測定各組SET8與RUNX2的mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以各組cDNA為模板，GAPDH作為內(nèi)參照。PCR引物由Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，見表1。反應(yīng)條件：GAPDH條件為95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)28次，繼續(xù)72℃延伸10 min。RUNX2條件為95℃變性 30 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 40 s，循環(huán) 30次，繼續(xù)72℃延伸10 min。SET8條件為95℃變性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸40 s，循環(huán)38次，繼續(xù)72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳后，采集圖像進(jìn)行分析。

1.5 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測VSMCs內(nèi)SET8、RUNX2蛋白的表達(dá) 采用蛋白提取試劑提取轉(zhuǎn)染后3組的細(xì)胞總蛋白。應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度，煮沸變性后按每

孔總蛋白50μg加樣，采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，電泳條件為95 V電泳1.5 h。之后用干轉(zhuǎn)儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間為0.5 h。后放入5%的脫脂奶粉中于37℃恒溫箱中封閉2 h。一抗4℃孵育過夜，一抗稀釋比例分別為（GAPDH 1∶10 000，RUNX2 1∶500，SET8 1∶500）。次日洗膜，放入鼠二抗中（二抗稀釋比例為1∶10 000），室溫?fù)u床孵育1 h，ECL顯色并應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 ALP活性測定 細(xì)胞轉(zhuǎn)染干預(yù)7 d后棄上清液，用PBS緩沖液洗2次，加適量質(zhì)量濃度1%的TritonX?100溶液，4℃冰箱靜置24 h，反復(fù)吹打細(xì)胞使其充分裂解，離心后棄沉淀物取上清液，按照ALP活性試劑盒說明書進(jìn)行操作，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法于酶標(biāo)儀520 nm波長處測定ALP的吸光度值，同時提取胞質(zhì)蛋白，應(yīng)用BCA法測定蛋白質(zhì)的含量，用以校正ALP的活性（U/mg）。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SET8-shRNA對VSMCs SET8 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 SET8-shRNA轉(zhuǎn)染VSMCs 48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率為50%。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，SET8-shRNA組VSMCs細(xì)胞中SET8 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均低于正常對照組和空質(zhì)粒組（均P＜0.05），正常對照組與空質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

2.2 SET8-shRNA對VSMCs RUNX2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，SET8-shRNA組RUNX2 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量均低于正常對照組和空質(zhì)粒組（均P＜0.05），正常對照組與空質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

2.3 SET8-shRNA對VSMCs ALP活性的影響 與正常對照組和空質(zhì)粒組比較，SET8-shRNA組ALP活性顯著降低（均P＜0.05），正常對照組與空質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

Fig.1 The influence of SET8-shRNA on VSMCs of SET8 expression圖1 SET8-shRNA對VSMCs SET8表達(dá)的影響

Fig.2 The influence of SET8-shRNA of RUNX2expression on the VSMCs圖2SET8-shRNA對VSMCs RUNX2表達(dá)的影響

Fig.3 The changes of alkaline phosphatase activity in VSMCs圖3 VSMCs各組ALP活性的變化

3 討論

血管鈣化在心血管疾病患者中普遍存在，主要表現(xiàn)在中膜鈣化，且與心血管事件的發(fā)生密切相關(guān)，而VSMCs是血管中膜的主要組成成分，是血管中膜發(fā)生鈣化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［6-7］。VSMCs向成骨樣轉(zhuǎn)化是血管鈣化的重要機(jī)制之一［8］。Quarles［2］研究發(fā)現(xiàn)，中膜鈣化是一個主動的、受細(xì)胞和基因調(diào)控的、似成骨形成的過程，其特性為成骨樣分化。因此，抑制VSMCs的轉(zhuǎn)分化是減少血管鈣化的關(guān)鍵。SET8在腫瘤中發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用［9］。鑒于此，本研究通過干擾大鼠VSMCs SET8的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SET8可明顯抑制大鼠VSMCs RUNX2 mRNA和蛋白的表達(dá)，提示SET8可能參與了大鼠VSMCs向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程。

Linscott等［10］研究發(fā)現(xiàn) SET8 能夠特異性單甲基化組蛋白H4K20，能招募特異的調(diào)節(jié)蛋白，在細(xì)胞內(nèi)具有調(diào)控組蛋白修飾、調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控細(xì)胞周期等作用，其主要參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)移分化等多種細(xì)胞生理功能。RUNX2是轉(zhuǎn)錄因子runt家族成員之一，是調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨、軟骨轉(zhuǎn)化所必需的核心轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用［11］。有研究表明SET8作為共刺激因子參與了Wnt調(diào)控靶蛋白RUNX2表達(dá)的作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化［12-14］。為了證實(shí)SET8是否與VSMCs的表型轉(zhuǎn)化直接相關(guān)，本研究通過對 VSMCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（NS-shRNA）和SET8-shRNA質(zhì)粒，結(jié)果顯示正常對照組與空質(zhì)粒組比較RUNX2表達(dá)水平無明顯變化，說明VSMCs轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對RUNX2表達(dá)無明顯影響。而SET8-shRNA組RUNX2表達(dá)水平均顯著低于正常對照組和空質(zhì)粒組，提示干擾SET8基因表達(dá)可抑制VSMCs向成骨、成軟骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。ALP活性與成骨細(xì)胞的活性及成骨作用有關(guān)，也是VSMCs表型轉(zhuǎn)化的早期指標(biāo)［15］。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組和空質(zhì)粒組比較，SET8-shRNA組ALP活性顯著降低，正常對照組與空質(zhì)粒組無明顯差異，進(jìn)一步提示干擾SET8基因表達(dá)可抑制VSMCs向成骨、成軟骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。

綜上所述，SET8-shRNA可有效抑制VSMCs中SET8的表達(dá)。干擾SET8基因表達(dá)可有效降低大鼠VSMCs RUNX2表達(dá)水平以及ALP活性，進(jìn)而抑制其表型轉(zhuǎn)化。本研究僅在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了干擾SET8可抑制VSMCs向成骨、成軟骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，其影響VSMCs表型轉(zhuǎn)化的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

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