張曉宇，白杰，康曉寧，靳麗君，王鵬，劉偉，王遵義△

乳腺癌是一種發(fā)病率和死亡率均很高的惡性腫瘤，據世界衛(wèi)生組織預測，到2025年將超過1 900萬例的癌癥被確診為乳腺癌［1］。腫瘤細胞呈現出的無序、無限制惡性增殖，以及肺、腦及骨等全身重要臟器的轉移，都將直接威脅人類的生命健康。通常認為乳腺癌是乳腺上皮細胞在多種致癌因子作用下發(fā)生了基因突變，致使細胞增殖失控。約5%～10%的乳腺癌患者有家族聚集的特點［2-3］。80%～85%具有易感基因突變的女性罹患乳腺癌的風險遠遠高于不具有易感基因突變的女性［4-5］。

PRDM 蛋白（PR domain zinc finger protein）是一個氨基端含有保守的PR同源區(qū)（簡稱PR區(qū)）的鋅指蛋白家族［6-7］。PRDM是Ca2+依賴磷脂結合蛋白，在機體的許多生理及病理過程中起重要作用，可調控細胞完整性、細胞分化、生長及凋亡，還可抑制腫瘤細胞的生長等。PRDM與腫瘤關系密切，其基因啟動子甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。目前PRDM家族基因的研究主要集中于肺癌、前列腺癌、腎癌和淋巴瘤，涉及乳腺癌的研究較少。經甲基轉移酶抑制劑等處理后，因基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化而失活的基因可以恢復mRNA的轉錄而重新表達。5-氮雜-2′-脫氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR）是一種最常用的DNA甲基轉移酶抑制劑，其作用機制是通過與DNA甲基轉移酶共價結合，降低DNA甲基轉移酶的生物活性，從而降低甲基化水平。本研究采用不同濃度5-Aza-CdR處理乳腺癌細胞Hs578T，探究PRDM10基因甲基化對乳腺癌細胞Hs578T增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞系Hs578T購于中國科學院上海細胞庫，由河北省滄州市中心醫(yī)院中心實驗室保存。Hs578T使用含有10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司），放置于37℃、5%CO2、95%空氣濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞單層貼壁生長，取對數期生長細胞用于實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）溶液、二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）、5-Aza-CdR、Trizol均購自美國 Sigma公司。PRDM10抗體和羊抗兔IgG購自Affinity公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。Mini BEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0試劑盒購自日本TaKaRa公司，EZ-DNA Methylation-Gold KitTMDNA甲基化修飾試劑盒購自美國Zymo公司，Access RT-PCR system試劑盒購自美國Promega公司，ECL化學發(fā)光試劑盒購自上海靜融生物科技有限公司。ELX800自動酶標儀購自美國Bio-Tek公司，紫外凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司，HIPAS-1000型圖像分析系統購自武漢華海公司，全自動多功能酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法測定5-Aza-cdR對Hs578T增殖的影響 Hs578T細胞消化計數后，將2 000個細胞接種在96孔板的每個孔內，加入100μL含血清培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)，共接種4塊板。24 h細胞完全貼壁，分別用0（對照組）、1、3和5μmol/L 5-Aza-CdR處理細胞，調整每孔終體積為200μL，每個濃度設置5個復孔。分別于處理24、48、72和96 h后測量細胞量，每孔加入5 g/L的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸凈培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，在搖床上輕柔搖勻，孵育1 h。待MTT結晶充分溶解，在ELX800自動酶標儀上讀取每個孔的光密度（OD）值（570 nm）。每個實驗重復3次。

1.2.2 MSP檢測PRDM10基因啟動子甲基化狀態(tài) 采用甲基化特異性PCR法（Methylation-specific PCR，MSP）檢測5-Aza-CdR對人乳腺癌細胞Hs578T中PRDM10基因啟動子甲基化狀態(tài)的影響。分別收集0（對照組）、1、3和5μmol/L 5-Aza-CdR處理72 h的人乳腺癌細胞Hs578T，每個濃度設置5個復孔。采用Mini BEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0試劑盒提取基因組DNA。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性后，采用EZ-DNA Methylation-Gold KitTMDNA甲基化修飾試劑盒進行DNA甲基化修飾。擴增引物采用MethyPrimer軟件（http：//www.urogene.org/cgibin/methprimer/methprimer.cgi）設計，委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PRDM10甲基化（PRDM10-M）的引物序列：上游 5′-TGGTTTTTTTGTAGATTGAATAAGC-3′，下游 5′-TAAACTCTATAAACCCCATACCGTA-3′，擴增片段120 bp。PRDM10未甲基化（PRDM10-UM）的引物序列：上游 5′-TGGTTTTTTTGTAGATTGAATAAGC-3′，下游 5′-TAAACTCTATAAACCCCATACCGTA-3′，擴增片段 118 bp。反應體系 50μL，包括去離子水 16μL、2×Taq Master Mix 25μL、DNA模板3μL、濃度為10μmol/L的上、下游引物各3μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸60 s，共 35個循環(huán)，72℃延伸 5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統掃描采集圖像，對擴增產物條帶進行OD值半定量測量。實驗重復3次。

1.2.3 RT-PCR檢測PRDM10的mRNA表達水平 將1×105個細胞接種至6孔板中，貼壁后分別用0（對照組）、1、3和5μmol/L 5-Aza-CdR處理細胞72 h，每個濃度設置5個復孔，用Trizol提取細胞總RNA，并反轉錄成cDNA。擴增引物分別利用 Primer 3軟件（http：//primer3.ut.ee/）設計，委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PRDM10基因的引物序列：上游 5′-TGGCCCTGCTATGAATGTAAC-3′，下游5′-GGGATTGGGATAGTGGTCTGT-3′，擴增片段 323 bp。參照Access RT-PCR system試劑盒說明書進行反轉錄和PCR擴增，50μL反應體系添加0.1μg模板，上、下游引物的終濃度分別為1μmol/L。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性 30 s，57℃退火60 s，72℃延伸 60 s，共 35個循環(huán)，72℃延伸3 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統掃描采集圖像，對擴增產物條帶進行OD值半定量測量。實驗重復3次。

1.2.4 Western blot檢測PRDM10的蛋白表達水平 將1×105個細胞接種至6孔板，貼壁后分別用0（對照組）、1、3和5μmol/L 5-Aza-CdR處理細胞72 h，每個濃度設置5個復孔。處理結束后收集并裂解細胞，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白量。樣本經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（100 V恒壓）分離，然后按照凝膠面積以0.65 mA/cm2恒流電轉移1.5 h將蛋白自凝膠轉印至PVDF膜。PVDF膜經5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入1∶1 000稀釋的兔抗人PRDM10抗體，4℃孵育過夜，TBST漂洗后用1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗孵育1.5 h，漂洗后用ECL化學發(fā)光試劑盒增強發(fā)光，X線膠片顯影。利用HIPAS-1000型圖像分析系統對X線膠片上的條帶進行OD值測量。以β-actin蛋白作為內參。實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件包對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示。處理前后兩樣本均數比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗；不同時點多組間比較采用重復測量設計的方差分析；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5-Aza-CdR對人乳腺癌細胞Hs578T增殖的影響 （1）組間比較。24 h時，0、1、3、5 μmol/L 5-Aza-CdR組Hs578T的OD值差異無統計學意義（P＞0.05）；48 h時，3、5μmol/L組 OD 值低于 0μmol/L組（P＜0.05）；72 h和 96 h時，1、3、5μmol/L 組均低于 0μmol/L，5μmol/L 組低于 1μmol/L（P＜0.05）。（2）組內比較。0μmol/L組OD值隨時間逐漸增高，組間多重比較差異均有統計學意義；1μmol/L組OD值 48、72、96 h 均高于 24 h，96 h 高于 48 h（P＜0.05）；3 μmol/L 組 OD 值 48、72、96 h 均高于 24 h，同時 96 h高于 48 h（P＜0.05）；5μmol/L組 OD 值不同時點間差異無統計學意義。組間和處理時間之間存在交互效應（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of the cell growth after treatment with different concentrations of 5-Aza-CdR表1 不同濃度5-Aza-CdR處理細胞后細胞生長情況比較（n=5，±s）

Tab.1 Comparison of the cell growth after treatment with different concentrations of 5-Aza-CdR表1 不同濃度5-Aza-CdR處理細胞后細胞生長情況比較（n=5，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F 組間=10.087，F 時間 =165.117，F 交互=73.334，均 P＜0.05；組間比較：a與 0μmol/L 比較，b與 1μmol/L 比較，c與 3μmol/L 比較，P＜0.05；組內比較：A與 24 h 比較，B與 48 h 比較，C與72 h比較，P＜0.05

5-Aza-CdR濃度0μmol/L 1μmol/L 3μmol/L 5μmol/L F OD值24 h 0.43±0.21 0.43±0.13 0.44±0.14 0.43±0.12 0.001 48 h 0.71±0.14A 0.58±0.11A 0.49±0.14aA 0.42±0.13a 4.503＊72 h 0.96±0.18AB 0.62±0.11aA 0.52±0.11aA 0.42±0.12ab 14.886＊＊96 h 1.36±0.17ABC 0.67±0.15aAB 0.56±0.11aAB 0.42±0.15ab 40.543＊＊F 279.910＊＊35.033＊＊19.977＊＊0.043

2.2 5-Aza-CdR對人乳腺癌細胞Hs578T中PRDM10基因甲基化的影響 （1）組間比較。處理前，0、1、3、5μmol/L 組 OD 值各組間差異均無統計學意義。處理后，0～5μmol/L組OD值逐漸降低，3μmol/L與5μmol/L組間比較差異無統計學意義，其余各組間多重比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。（2）組內比較。1、3、5μmol/L 組處理后顯著低于處理前（P＜0.05）見表 2、圖 1。

2.3 5-Aza-CdR對人乳腺癌細胞Hs578TPRDM10表達的影響 RT-PCR和Western blot結果均顯示，不同濃度5-Aza-CdR處理細胞后，0～5μmol/L組人乳腺癌細胞Hs578TPRDM10mRNA和蛋白表達水平均逐漸升高，且組間多重比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表 3、圖 2。

3 討論

DNA甲基化和組蛋白甲基化在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。有研究證實BRCA1基因啟動子甲基化能夠引起基因沉默，進而增加機體對鉑類藥物的敏感性［8］。在乳腺癌組織中p16甲基化能夠引起基因沉默和蛋白表達降低［9］。有多種抑癌基因被證實在乳腺癌組織中發(fā)生不同程度的甲基化，例如GSTP1、PTEN、MGMT、RARβ2、p16INK4A和CCND2等［10-13］。Goebel等［14］采用甲基化和未甲基化的CpG處理人類乳腺癌細胞系BT-20和Hs578T，然后篩選差異表達基因，發(fā)現CHAC1mRNA表達升高可能是預測乳腺癌復發(fā)風險升高的一個獨立指標。以上研究說明基因甲基化在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、治療和預后評價中具有重要意義，這也是筆者研究PRDM10基因在乳腺癌中作用的理論基礎。DNA甲基化可引起基因組中相應區(qū)域染色質結構變化，染色質高度螺旋化，凝縮成團，失去轉錄活性［15］。基因組中60%～90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地組成CpG島，位于結構基因啟動子的核心序列和轉錄起始點。有研究表明，腫瘤抑制基因BRCA1的啟動子區(qū)域的CpG島被過度甲基化時，可以導致抑癌基因的轉錄沉默，進而影響B(tài)RCA1參與散發(fā)性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程［16］。上述研究初步探討了基因甲基化和去甲基化在癌癥中的作用機制，為筆者通過去甲基化處理PRDM10基因進而研究去甲基化試劑對乳腺癌增殖影響的相關機制提供了參考。去甲基化試劑5-Aza-CdR通過與DNA甲基轉移酶結合，降低DNA活性，使不同的抑癌基因得以開放，進而抑制腫瘤的發(fā)展［17］。本研究用不同濃度的5-Aza-CdR處理乳腺癌細胞Hs578T，進而研究5-Aza-CdR對Hs578T的增殖以及PRDM10基因甲基化的影響。

Fig.1 The methylation levels of PRDM10 gene in Hs578T before and after treated with different concentrations of 5-Aza-CdR圖1 不同濃度5-Aza-CdR處理前后Hs578T中PRDM10基因甲基化水平

Tab.2 Comparsion of the methylation levels of PRDM10 before and after treatment with different concentrations of 5-Aza-CdR表2 不同濃度5-Aza-CdR處理細胞前后PRDM10的甲基化水平比較 （n=5，±s）

Tab.2 Comparsion of the methylation levels of PRDM10 before and after treatment with different concentrations of 5-Aza-CdR表2 不同濃度5-Aza-CdR處理細胞前后PRDM10的甲基化水平比較 （n=5，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與 0 μmol/L 比較，b與 1 μmol/L 比較，P＜0.05

5-Aza-CdR濃度0μmol/L 1μmol/L 3μmol/L 5μmol/L F OD值處理前27.45±3.87 25.94±2.74 28.93±2.65 29.86±3.69 1.369處理后27.80±3.05 16.41±4.26a 0.05±0.03ab 0.05±0.05ab 133.738＊＊t 0.245 4.354＊24.205＊＊18.231＊＊

Tab.3 Comparsion of the mRNA and protein levels of PRDM10 after treatment with different concentrations of 5-Aza-CdR表3 不同濃度5-Aza-CdR處理細胞后PRDM10的mRNA和蛋白表達水平比較 （n=5）

Fig.2 The mRNA and protein levels of PRDM10 gene in Hs578 after treatment with different concentrations of 5-Aza-CdR圖2 不同濃度5-Aza-CdR處理72 h后PRDM10 mRNA和蛋白的表達水平

PRDM10是PRDM家族的一員，在關節(jié)滑膜組織中表達，與關節(jié)病的發(fā)病有關，可作為炎性關節(jié)炎和類風濕性關節(jié)炎的標志物［18］。多形性未分化肉瘤中反復出現PRDM10基因融合，對其臨床分型具有重要作用［19］。目前尚少見PRDM10基因在其他乳腺癌細胞和乳腺組織中表達的報道。筆者前期研究發(fā)現，PRDM10的甲基化狀態(tài)與乳腺癌細胞增殖功能密切相關［20］，筆者進一步研究了去甲基化試劑對乳腺癌細胞增殖功能以及PRDM10的甲基化狀態(tài)影響，發(fā)現PRDM10基因在乳腺癌細胞Hs578T中不表達，這可能是相關研究較少的原因之一。本研究通過甲基化水平的檢測發(fā)現，PRDM10基因在Hs578T中處于完全甲基化，并且3μmol/L的5-Aza-CdR能夠使PRDM10基因甲基化狀態(tài)完全逆轉。MTT實驗結果顯示，去甲基化試劑5-Aza-CdR能夠明顯地抑制Hs578T細胞的生長，提示去甲基化藥物具有臨床開發(fā)潛力。此外，MTT實驗還顯示，5-Aza-CdR的濃度越高、處理時間越長，對Hs578T細胞增殖的作用越顯著。但是如果濃度過低或者處理時間不夠長這種抑制作用不顯著。

綜上所述，5-Aza-CdR抑制人乳腺癌細胞Hs578T的增殖，可能與該細胞中PRDM10基因的去甲基化有關。

［1］Fotedar V，Seam RK，Gupta MK，et al.Knowledge of risk factors and early detection methods and practices towards breast cancer among nurses in Indira Gandhi Medical College，Shimla，Himachal Pradesh，India［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（1）：117-120.doi：10.7314/APJCP.2013.14.1.117.

［2］Pathmanathan N，Bilous AM.HER2 testing in breast cancer：an overview of current techniques and recent developments［J］.Pathology，2012，44 （7） ：587-595.doi：10.1097/PAT.0b013e328359cf9a.

［3］孫軒，殷實，曹旭晨.腋窩逆行淋巴示蹤術預防乳腺癌相關水腫的臨床可行性分析［J］.天津醫(yī)藥，2017，45（1）：64-68.Sun X，Yin S，Cao XC.Clinical feasibility of axillary reverse mapping for preventing breast cancer related lymphedema［J］.Tianjin Med J，2017，45（1）：64-68.doi：10.11958/20161457.

［4］Hulka BS，Moorman PG.Breast cancer：hormones and other risk factors［J］.Maturitas，2001，38（1）：103-116.doi：10.1016/S0378-5122（00）00196-1.

［5］Park A.Breast-cancer basics.Diagnosis and treatment keep changing.Here’s what you need to know now［J］.Time，2007，170（16）：46-47.

［6］Wu H，Min J，Lunin VV，et al.Structural biology of human H3K9 methyltransferases［J］.PLoS One，2010，5（1）：e8570.doi：10.1371/journal.pone.0008570.

［7］Fumasoni I，Meani N，Rambaldi D，et al.Family expansion and gene rearrangements contributed to the functional specialization of PRDM genes in vertebrates［J］.BMC Evol Biol，2007，7（1）：187.doi：10.1186/1471-2148-7-187.

［8］Stefansson OA，Alberto V，August V，et al.BRCA1 epigenetic inactivation predicts sensitivity to platinum-based chemotherapy in breast and ovarian cancer［J］.Epigenetics，2012，7（11）：1225-1229.doi：10.4161/epi.22561.

［9］Lee JJ，Ko E，Cho J，et al.Methylation and immunoexpression of p16INK4a tumor suppressor gene in primary breast cancer tissue and their quantitative p16INK4a hypermethylation in plasma by real-time PCR［J］.Korean J Pathol，2012，46（6）：554-561.doi：10.4132/KoreanJPathol.2012.46.6.554.

［10］Baldwin RL，Nemeth E，Hang T，et al.BRCA1 promoter region hypermethylation in ovarian carcinoma：a population-based study［J］.Cancer Res，2000，60（19）：5329-5333.

［11］Rhodes A，Cusack RJ，Newman PJ，et al.A randomised，controlled trial of the pulmonary artery catheter in critically ill patients［J］.Intensive Care Med，2002，28（3）：256-264.doi：10.1007/s00134-002-1206-9.

［12］Harvey S，Harrison DA，Singer M.Assessment of the clinical effectiveness of pulmonary artery catheters in management of patients in intensive Care（PAC-Man）：a randomised controlled trial［J］.Lancet，2005，14（12）：472-477.doi：10.1016/S0140-6736（05）67061-4.

［13］Sandham JD，Douglas R，Hull D.A randomized，controlled trial of the use of pulmonary-artery catheters in high-risk surgical patients［J］.N Engl J Med，2003，348（1）：5-14.doi：10.1056/NEJMoa021108.

［14］Goebel G，Berger R，Strasak AM，et al.Elevated mRNA expression of CHAC1 splicing variants is associated with poor outcome for breast and ovarian cancer patients［J］.Br J Cancer，2012，106（1）：189-198.doi：10.1038/bjc.2011.510.

［15］江莉，覃莉，李慕軍.人類胚胎發(fā)育、精子發(fā)生與DNA甲基化關系的研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2013，19（2）：197-199.Jiang L，Qin L，Li MJ.Advances in the relationship between human embryo development，spermatogenesis and DNA methylation［J］.Medical Review，2013，19（2）：197-199.doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2013.02.002.

［16］任婕，魏敏杰，金鋒，等.散發(fā)性乳腺癌組織中BRCA1基因啟動子甲基化與蛋白表達的相關性［J］.中華腫瘤防治雜志，2007，14（3）：161-164.Ren J，Wei MJ，Jin F，et al.Correlation between methylation of BRCA1 gene promoter and protein expression in sporadic breast cancer［J］.Chinese Journal of Cancer Prevention and Treatment，2007，14（3）：161-164.doi：10.3969/j.issn.1673-5269.2007.03.001.

［17］Hirasawa Y，Arai M，Imazeki F，et al.Methylation status of genes upregulated by demethylating agent 5-aza-2′-deoxycytidine in hepatocellular carcinoma［J］.Oncology，2006，71（1/2）：77.doi：10.1159/000100475.

［18］Park JA，Kim TH，Lee B，et al.Expression of PRDM10 in arthritic synovial derived tissues［J］.Genes Genom，2013，35（6）：685-691.doi：10.1007/s13258-013-0119-z.

［19］Hofvander J，Tayebwa J，Nilsson J，et al.Recurrent PRDM10 Gene Fusions in Undifferentiated Pleomorphic Sarcoma［J］.Clin Cancer Res，2015，21（4）：864-869.doi：10.1158/1078-0432.CCR-14-2399.

［20］張曉宇，康曉寧，劉偉，等.FOS樣抗原1對乳腺癌細胞MDAMB-231增殖、侵襲和PRDM10基因甲基化的影響[J].天津醫(yī)藥，2017，45（12）：1237-1241.Zhang XY，Kang XN，Liu W，et al.Effects of FOSL1 on cell proliferation，cell invasiveness and the methylation of PRDM10 gene in breast cancer cell line MDA-MB-231[J].Tianjin Med J，2017，45（12）：1237-1241.doi:10.11958/20170819.