孫雯雯，宋林，李宏峰，范玉強(qiáng)

替加氟為氟尿嘧啶的衍生物，目前是治療惡性消化道腫瘤的常用化療藥物，但會(huì)對(duì)消化系統(tǒng)和血液系統(tǒng)等產(chǎn)生一系列的不良反應(yīng)［1］。山藥能增加T淋巴細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，山藥提取物中山藥多糖具有較好地誘導(dǎo)肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制血管新生、抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)耐藥性、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種抗癌作用［2-4］。本研究旨在探討山藥提取物與替加氟聯(lián)合使用對(duì)結(jié)腸癌的體內(nèi)外殺傷效果。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞（美國(guó)ATCC?HTB-38TM）由天津市腫瘤醫(yī)院惠贈(zèng)；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；0.25%胰酶消化液購(gòu)自索萊寶公司；CD133磁珠抗體購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司；MTT試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；一抗兔抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）抗體，山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；山藥飲片購(gòu)自宛西制藥廠，生藥用8倍量的水提取3次，每次2 h，合并濾液，先經(jīng)70℃旋蒸濃縮，后轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中于70℃真空至干，提取率為2.78%，提取物主要成分是多糖，多糖含量為（324.90±0.82）mg/g；替加氟購(gòu)自辰欣藥業(yè)股份有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)BALB/c nude小鼠購(gòu)自維通利華公司，動(dòng)物合格證號(hào)為11400500018046，雌性，3～4周齡，40只，體質(zhì)量 16～18 g，飼養(yǎng)于 IVC 系統(tǒng)內(nèi)。

1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜（Thermo公司，美國(guó)）；顯微鏡（Olympus公司，日本）；流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)）；離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)）；磁珠分選器（Miltenyi公司，德國(guó)）；IVC系統(tǒng)主機(jī)（蘇州市蘇杭科技器材有限公司，中國(guó)）。

1.3 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成5×104個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入180μL。培養(yǎng)24 h后，加入受試藥物。實(shí)驗(yàn)共分4組：（1）空白對(duì)照組，加入等體積含二甲基亞砜（DMSO）的生理鹽水。（2）山藥提取物組，調(diào)節(jié)終質(zhì)量濃度為125 mg/L。（3）替加氟組，調(diào)節(jié)終質(zhì)量濃度為36 mg/L。（4）聯(lián)合治療組，調(diào)節(jié)山藥提取物終質(zhì)量濃度為125 mg/L，并且替加氟終質(zhì)量濃度為36 mg/L。將平板在37℃、5%CO2的溫箱中孵育36 h，去除培養(yǎng)液。每孔加入含0.5 g/L MTT的PBS液100μL，37℃溫育36 h。棄去上清液，每孔加入100μL DMSO，置于全自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞比例 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞，用0.25%胰酶/0.2%EDTA消化液消化，觀察細(xì)胞變圓、連接消失后，用完全培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液吸入10 mL離心管，400×g，離心 5 min，棄去培養(yǎng)液，用 80μL緩沖液（0.5%BSA，2 mmol/L EDTA，0.01 mmol/L PBS）洗滌，重懸。加入20μL FC受體阻斷劑，加入鼠抗人CD133單抗，再加入上述4組藥物，同時(shí)在對(duì)照細(xì)胞中添加相應(yīng)的同型對(duì)照小鼠IgG2a-PE 10μL，4℃避光放置 30 min，PBS洗 2次，除去未結(jié)合一抗，400×g，離心5 min，除去上清液，各管加入500μL PBS重懸；標(biāo)記好的細(xì)胞懸液經(jīng)200目篩網(wǎng)濾過(guò)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133+細(xì)胞（HT-29細(xì)胞的干細(xì)胞）的比例。

1.5 建立結(jié)腸癌荷瘤裸鼠模型 BALB/c裸鼠40只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，將0.2 mL細(xì)胞濃度為5×105/mL HT-29細(xì)胞溶于1 mL無(wú)血清培養(yǎng)基與matrigel基底膜1∶1混合液中，用微量注射器，接種于BALB/c裸鼠右側(cè)腋下，觀察裸鼠成瘤情況，接種部位出現(xiàn)質(zhì)地較硬的腫瘤結(jié)節(jié)等指征認(rèn)定為成瘤。

1.6 荷瘤裸鼠的治療 將上述荷瘤裸鼠完全隨機(jī)分為4組，每組10只。（1）空白對(duì)照組，尾靜脈注射生理鹽水，每天1次，每次 0.2 mL。（2）山藥提取物組，按《中國(guó)藥典》規(guī)定，小鼠日服劑量是每千克體質(zhì)量4.5 g（生藥量），提取物提取率為2.78%，故小鼠給藥劑量為125 mg/kg，每天1次灌胃0.2 mL。（3）替加氟組，尾靜脈注射替加氟化療藥物，劑量為36 mg/kg，連續(xù)5 d給藥。（4）聯(lián)合治療組（山藥聯(lián)合替加氟組），尾靜脈注射替加氟化療藥物，劑量為36 mg/kg，連續(xù)5 d給藥；同時(shí)按上述山藥提取物組每天1次灌胃0.2 mL配制的溶液。自給藥日起，每天觀察各組小鼠的生存狀況及死亡情況，給藥6周后處死荷瘤鼠，取瘤組織稱質(zhì)量。計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（1-給藥組瘤質(zhì)量/對(duì)照組瘤質(zhì)量）×100%

1.7 VEGF的檢測(cè) 給藥6周后處死4組裸鼠，分離皮下移植瘤組織，先放置在液氮中，然后保存在-80℃的冰箱保存。將移植瘤組織切片，脫水，抗原修復(fù)（包括熱修復(fù)、胰酶修復(fù)等），抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，一抗用兔抗VEGF抗體封閉，孵育切片30 min，二抗用山羊抗兔抗體孵育切片30 min，然后用DAB工作液顯色，用蘇木素復(fù)染后，鹽酸乙醇分化，再用氨水返藍(lán)。自來(lái)水沖洗切片、切片脫水、透明、封片，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。

VEGF讀片標(biāo)準(zhǔn)為+/-：每個(gè)高倍視野下，＜2%的癌細(xì)胞細(xì)胞漿呈棕黃色染色者；+：每個(gè)高倍視野下，2%～9%的癌細(xì)胞細(xì)胞漿呈棕黃色染色者；++：每個(gè)高倍視野下，10%～49%的癌細(xì)胞細(xì)胞漿呈棕黃色染色者；+++：每個(gè)高倍視野下，50%～79%的癌細(xì)胞細(xì)胞漿呈棕黃色染色者；++++：每個(gè)高倍視野下，≥80%的癌細(xì)胞細(xì)胞漿呈棕黃色染色者。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用2×2析因設(shè)計(jì)的方法分析獨(dú)立效應(yīng)和組間交互效應(yīng)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山藥提取物聯(lián)合替加氟對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞形態(tài)的影響 藥物與細(xì)胞共孵育72 h后，倒置顯微鏡下可見(jiàn)，對(duì)照組HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，折光率較高，胞體大，形態(tài)成梭形或多邊形，胞質(zhì)均勻透明，核仁清楚，生長(zhǎng)良好。3個(gè)給藥組細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞逐漸變小、變圓，折光率減弱，核濃縮，部分脫落漂浮，裂解，見(jiàn)圖1。

2.2 山藥提取物聯(lián)合替加氟對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖抑制及結(jié)腸癌干細(xì)胞（CD133+）表達(dá)的影響 3個(gè)給藥組對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖能力的抑制作用明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05）；聯(lián)合治療組對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖能力的抑制作用明顯高于山藥提取物組和替加氟組（P＜0.05）；山藥提取物組與替加氟組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白對(duì)照組相比，3個(gè)給藥組細(xì)胞中CD133+細(xì)胞比例明顯下降（P＜0.05）；聯(lián)合治療組較山藥提取物組、替加氟組明顯下降（P＜0.05）；山藥提取物組與替加氟組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

Fig.1 Effects of yam extract with tegafur on the morphology of colon cancer HT-29 cells（×400）圖1 山藥提取物聯(lián)合替加氟對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞形態(tài)的影響（×400）

Tab.1 Effects of yam extract combined with tegafur on the proliferation and proportion of CD133+of colon cancer cell HT-29表1 山藥提取物聯(lián)合替加氟對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖抑制及CD133+比例的影響 （n=5，±s）

Tab.1 Effects of yam extract combined with tegafur on the proliferation and proportion of CD133+of colon cancer cell HT-29表1 山藥提取物聯(lián)合替加氟對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖抑制及CD133+比例的影響 （n=5，±s）

＊＊P＜0.01；表 2 同

組別空白對(duì)照組山藥提取物組替加氟組聯(lián)合治療組抑制率（%）0 18.14 19.61 30.85 F 山藥提取物F 替加氟F交互OD值1.086±0.103 0.889±0.091 0.873±0.086 0.751±0.073 28.331＊＊35.221＊＊62.854＊＊CD133+細(xì)胞比例（%）36.59±7.62 26.27±6.30 26.01±6.18 17.03±6.03 46.579＊＊45.392＊＊74.136＊＊

2.3 山藥提取物聯(lián)合替加氟對(duì)荷瘤裸鼠生存狀況的影響 治療期間，山藥提取物組和聯(lián)合治療組荷瘤裸鼠始終活動(dòng)自如，進(jìn)食進(jìn)水正常，情緒平穩(wěn)?？瞻讓?duì)照組在治療第3周開(kāi)始出現(xiàn)活動(dòng)受阻的現(xiàn)象。替加氟組在注射化療藥物后，荷瘤裸鼠活動(dòng)減弱，進(jìn)水進(jìn)食減少，精神萎靡，出現(xiàn)弓背現(xiàn)象，在治療第2周出現(xiàn)瀕死狀態(tài)。

2.4 山藥提取物聯(lián)合替加氟對(duì)荷瘤裸鼠的抑瘤作用 治療后，3個(gè)給藥組荷瘤裸鼠的瘤體質(zhì)量明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.05），聯(lián)合治療組荷瘤裸鼠的瘤體質(zhì)量明顯低于山藥提取物組和替加氟組（P＜0.05）；山藥提取物組與替加氟組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表 2，圖 2。

Tab.2 Changes of tumor body mass and inhibitory rates after treatment in four groups表2 各治療組對(duì)荷瘤瘤體質(zhì)量的抑制作用（n=10，±s）

Tab.2 Changes of tumor body mass and inhibitory rates after treatment in four groups表2 各治療組對(duì)荷瘤瘤體質(zhì)量的抑制作用（n=10，±s）

＊＊P＜0.01

組別空白對(duì)照組山藥提取物組替加氟組聯(lián)合治療組抑瘤率（%）-15.88 25.34 38.18 F 山藥提取物F 替加氟F交互實(shí)體瘤質(zhì)量（g）2.96±0.52 2.49±0.47a 2.21±0.44a 1.83±0.36abc 32.214＊＊52.684＊＊89.219＊＊

Fig.2 Final tumor volumes after immunotherapy圖2 治療結(jié)束各組瘤體積大小

2.5 山藥提取物聯(lián)合替加氟對(duì)瘤體VEGF陽(yáng)性表達(dá)率的影響 VEGF表達(dá)于細(xì)胞膜或胞漿，光鏡下觀察結(jié)果，胞漿出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒，染色強(qiáng)度高于背景者為蛋白表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，強(qiáng)陽(yáng)性（+++）表達(dá)為清晰的棕褐色顆粒。治療后，空白對(duì)照組、山藥提取物組、替加氟組、聯(lián)合治療組瘤體VEGF陽(yáng)性的表達(dá)率分別80%、60%、50%、30%，見(jiàn)圖3。

Fig.3 Pictures showing immunohistochemical staining of VEGF in tumor under the optical microscope（×200）圖3 瘤體標(biāo)本VEGF免疫組化染色光學(xué)顯微鏡下觀察（×200）

3 討論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤，中醫(yī)認(rèn)為，結(jié)腸癌是由于濕、瘀、熱、毒等因素致臟腑功能紊亂、氣血陰陽(yáng)失調(diào)而引起的。CD133為五次跨膜糖蛋白家族的一員，開(kāi)始被認(rèn)為是人造血干細(xì)胞的選擇標(biāo)志，近年來(lái)的研究表明CD133可以作為鑒定及分離結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志［5-6］。

長(zhǎng)期以來(lái)氟尿嘧啶始終是治療惡性消化道腫瘤的首選藥物，替加氟為氟尿嘧啶的衍生物，在體內(nèi)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榉蜞奏ざ鹱饔谩Ｆ淇拱┳饔梅绞绞且訰NA為靶向的細(xì)胞毒性作用。有報(bào)道替加氟會(huì)對(duì)消化系統(tǒng)和血液系統(tǒng)產(chǎn)生一系列的不良反應(yīng)，如胃腸道反應(yīng)惡心嘔吐、骨髓抑制、白細(xì)胞降低、血小板減少等［1］。本研究發(fā)現(xiàn)，在體外實(shí)驗(yàn)中替加氟可以使結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞逐漸變小，核濃縮，部分脫落漂浮，進(jìn)而抑制了HT-29細(xì)胞的增殖，降低腫瘤干細(xì)胞的比例。替加氟對(duì)荷瘤裸鼠具有一定的抑瘤作用，抑瘤率達(dá)25.34%，但裸鼠出現(xiàn)了活動(dòng)減少，進(jìn)水進(jìn)食減少，精神萎靡等現(xiàn)象，說(shuō)明化療藥在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)機(jī)體的不良反應(yīng)較大。

中藥應(yīng)用于臨床抗癌治療歷史悠久。中藥具有多靶點(diǎn)、不易產(chǎn)生耐藥性、不良反應(yīng)小、多效應(yīng)、安全性高等優(yōu)點(diǎn)［7］。作為藥食同源的山藥具有較好的抗癌作用［2］，《本草綱目》謂其益腎氣，健脾胃，止泄痢，化痰涎，潤(rùn)皮毛。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，山藥可誘導(dǎo)黑色素瘤、肺癌、食管癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞凋亡［3-4］。其活性成分包括薯蕷皂苷、尿囊素、山藥多糖［8］、山藥黏液蛋白［9］、黃酮、微量元素等。山藥多糖具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用，可體外刺激刀豆蛋白誘發(fā)的T淋巴細(xì)胞增生，提升血清中IgG的濃度，進(jìn)而促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖［2］。趙國(guó)華等［3］用不同劑量的山藥多糖RDPS-Ⅰ喂養(yǎng)荷瘤鼠，當(dāng)劑量達(dá)50 mg/kg時(shí)，對(duì)Lewis肺癌有抑制效果；當(dāng)劑量達(dá)150 mg/kg時(shí)，對(duì)Lewis肺癌和B16黑色素瘤均有抑制效果。山藥可通過(guò)抑制MAPK、Akt、NF-κB等途徑抑制黏附分子的表達(dá)［10］。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)山藥提取物作用于結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞72 h后可使HT-29細(xì)胞逐漸變小，核濃縮，部分脫落漂浮，細(xì)胞增殖能力減弱，腫瘤干細(xì)胞的比例明顯降低；體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，山藥提取物對(duì)荷瘤裸鼠具有一定的抑瘤效果，治療期間荷瘤裸鼠始終活動(dòng)自如、進(jìn)食進(jìn)水正常，提示山藥提取物在抑瘤的同時(shí)不良反應(yīng)小。山藥提取物聯(lián)合替加氟，在體外的腫瘤細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)中均好于單獨(dú)使用山藥提取物組或替加氟組，表明山藥提取物和替加氟之間具有協(xié)同作用。

VEGF是腫瘤血管形成［11］、刺激腫瘤細(xì)胞進(jìn)行血液轉(zhuǎn)移［12］中最重要的生長(zhǎng)因子，其在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中具有重要作用，VEGF表達(dá)程度反映腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管構(gòu)建水平，直接反映了腫瘤生長(zhǎng)的速度和轉(zhuǎn)移的傾向。因此，抑制VEGF的產(chǎn)生、阻止其發(fā)揮作用是抗腫瘤血管生成進(jìn)而達(dá)到有效治療腫瘤的關(guān)鍵［13-15］。本研究通過(guò)免疫組化法觀察到聯(lián)合治療組VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于單獨(dú)使用山藥提取物組和替加氟組，結(jié)果表明山藥提取物聯(lián)合替加氟通過(guò)抑制腫瘤血管生成達(dá)到抑制腫瘤的效果，體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

據(jù)報(bào)道，山藥及其主要成分薯蕷皂苷元可通過(guò)調(diào)節(jié)脂蛋白脂質(zhì)酶表達(dá)，降低血清中三酰甘油水平，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、凋亡等，發(fā)揮預(yù)防氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸癌的發(fā)生［16］。以上結(jié)果均證明山藥具有較好的抗腫瘤活性，且在聯(lián)合化療藥應(yīng)用方面具有較好的前景。

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