李子健，黃英如，曾歡歡，汪 一，張 松

1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院針灸骨傷教研室，重慶市400016；2.中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶市400016

自體神經(jīng)移植是周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的金標準，然而來源限制、造成新的失神經(jīng)損傷等，限制了臨床應(yīng)用。同種異體神經(jīng)移植物能為臨床神經(jīng)缺損修復(fù)提供不同大小的神經(jīng)移植物，而周圍神經(jīng)低溫保存使同種異體神經(jīng)移植代替自體神經(jīng)移植成為可能[1-2]。然而，組織細胞低溫保存時的缺血、缺氧和低溫環(huán)境不可避免對保存組織細胞造成損傷，導(dǎo)致保存后周圍神經(jīng)的施萬細胞(Schwann's cells,SCs)失去活性甚至死亡，而SC是周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細胞，能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子和黏附分子，對神經(jīng)損傷后的軸突再生極為重要[3]。

冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(cold-inducible RNA binding protein,CIRP)是一種冷應(yīng)激蛋白，在溫和低溫、紫外線、缺氧等應(yīng)激條件下，CIRP被誘導(dǎo)表達[4-5]，通過參與調(diào)控細胞生長、衰老、凋亡等發(fā)揮對細胞的保護作用[6]。本實驗通過不同溫度誘導(dǎo)CIRP表達，觀察其對冷凍保存大鼠坐骨神經(jīng)的保護作用，及同種異體移植后神經(jīng)再生的影響，探討CIRP提高大鼠周圍神經(jīng)冷凍保存效果的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠102只，體質(zhì)量(200±20)g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(渝)2012-0001。12 h黑白交替，相對濕度65%～75%，室溫22～24℃。根據(jù)《醫(yī)學(xué)實驗動物管理實施細則》的要求，所用動物實驗研究均依照動物福利與倫理原則處理。

1.2 試劑與儀器

CIRP抗體：美國ABCAM公司。Bcl-2、Bax、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)單克隆抗體、CD4抗體：美國SANTA CRUZ公司。GAPDH抗體：美國NOVUS公司。β-actin、二抗(山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、DMSO、0.25%胰酶、高糖型DMEM培養(yǎng)基：美國HYCLONE公司。雙抗(青霉素-鏈霉素)：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。乙二醇：成都市科龍化工試劑廠。海藻糖：北京索萊寶科技有限公司。triton X-100：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。Calcein-AM：日本東仁化學(xué)科技有限公司。碘化丙啶(propidium iodide,PI)：上海前塵生物科技有限公司。大鼠白細胞介素(interleukin,IL)-6、干擾素(interferon,IFN)-γ ELISA試劑盒：上海滬尚生物科技有限公司。總RNA提取試劑盒、RR047A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：大連TaKaRa公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PCR引物：上海生工生物。

H-7500型透射電鏡：日本HITACHI公司。TCS-SP2型激光掃描共聚焦顯微鏡：德國LEICA公司。BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)：成都泰盟。電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、RT-PCR擴增儀：美國BIO-RAD公司。BX51正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。低溫高速離心機：德國SIGMA公司。

1.3 動物造模與分組

1.3.1 神經(jīng)采集及預(yù)處理

將上述大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，截取雙側(cè)坐骨神經(jīng)段15 mm，生理鹽水沖洗，大鼠斷頸處死。按照隨機數(shù)字表法將176條坐骨神經(jīng)置于含有10%FBS和1%雙抗的DMEM預(yù)處理液中，于不同溫度誘導(dǎo)處理24 h：4℃組(A組，n=44)、15℃組(B組，n=44)和32℃組(C，n=44)，并設(shè)立新鮮神經(jīng)組(D組，n=44)。

1.3.2 冷凍保存液配制、坐骨神經(jīng)冷凍保存及復(fù)溫

在DMEM溶液(含10%FBS、1%雙抗、0.2 mol/L海藻糖)中分別加入5%DMSO和5%乙二醇、10%DMSO和10%乙二醇、20%DMSO和20%乙二醇，配制成含5%、10%、20%冷凍保護劑的冷凍保存液。

將上述4組大鼠坐骨神經(jīng)浸入含5%、10%冷凍保護劑的冷凍保存液中室溫靜置各10 min，然后浸于含20%冷凍保護劑的冷凍保存液中，4℃放置30 min、-20℃放置1 h、-80℃放置1 h，最后將其轉(zhuǎn)入液氮中保存4周。

保存后神經(jīng)首先置于20%冷凍保護劑的冷凍保存液中37℃復(fù)溫3 min；然后依次置于10%、5%冷凍保護劑的冷凍保存液中各10 min，最后置于含有10%FBS和1%雙抗的DMEM溶液中。

1.3.3 移植術(shù)受體及分組

健康成年SPF級雄性Wistar大鼠91只，體質(zhì)量(200±20)g，作為待實驗大鼠。用上述保存后的4組坐骨神經(jīng)修復(fù)對應(yīng)Wistar大鼠(A′組、B′組、C′組和D′組)坐骨神經(jīng)10 mm缺損，每組14只。設(shè)立Sprague-Dawley大鼠新鮮坐骨神經(jīng)修復(fù)Wistar大鼠坐骨神經(jīng)缺損作為新鮮同種異體移植對照組(E′組)。選取7只健康成年SPF級雄性Wistar大鼠，10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，按照前文神經(jīng)采集方法所獲得的14根神經(jīng)作為供體神經(jīng)，將其移植于受體大鼠，作為F'組。

受體大鼠10%水合氯醛4 ml/kg腹腔麻醉，于右股后外側(cè)縱行切口，沿肌間隙鈍性分離，暴露、游離坐骨神經(jīng)，距梨狀肌下緣5 mm處整齊切除大鼠坐骨神經(jīng)造成10 mm缺損；將供體神經(jīng)修剪成10 mm長，6倍手術(shù)顯微鏡下，以9-0帶線縫合針行神經(jīng)外膜無張力間斷縫合4～6針，逐層關(guān)閉切口。手術(shù)均由單人操作完成，術(shù)后大鼠均不做特殊處理。

1.4 檢測指標

1.4.1 CIRP mRNA、蛋白表達

1.4.1.1 RT-PCR檢測CIRP mRNA表達

使用TRIzol法提取上述預(yù)處理各組大鼠坐骨神經(jīng)中總RNA。根據(jù)RR047A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA及在RT-PCR擴增儀擴增目的基因。使用GAPDH做內(nèi)參校正，計算各組間相對表達量?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 基因引物序列

1.4.1.2 Western blotting檢測CIRP蛋白表達

取上述預(yù)處理各組神經(jīng)組織約30 mg，按照10 ml/kg比例加入裂解液，勻漿，靜置1 h，12000 r/min離心15 min，抽取上清后按BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜，一抗(CIRP 1∶1000；GAPDH 1∶5000)4℃孵育過夜；TBST洗膜后，二抗(山羊抗兔IgG)室溫孵育60 min，TBST洗膜，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像，使用GAPDH做內(nèi)參；用Image J軟件進行定量分析，用目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值表示蛋白的相對表達量，生物學(xué)重復(fù)為6次。

1.4.2 冷凍保存后Calcein-AM/PI熒光染色

取上述冷凍保存4周后各組坐骨神經(jīng)各4條，另隨即取新鮮神經(jīng)4條作為新鮮對照組(E組)，修剪成2 mm長短神經(jīng)片段，浸入1%triton X-100中通透30 min，PBS沖洗，室溫下Calcein-AM(20 μmol/L)染色30 min，PBS洗滌，PI染色15 min，PBS洗滌，防熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察熒光強度，激發(fā)波長490 nm(綠色熒光)和535 nm(紅色熒光)，活細胞呈綠色熒光，死細胞呈紅色熒光。

1.4.3 Western blotting檢測冷凍保存后Bcl-2、Bax蛋白表達

按照上述Western blotting法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達，β-actin作為內(nèi)參，生物學(xué)重復(fù)為6次。

1.4.4 冷凍保存神經(jīng)分泌NGF、GDNF檢測

取上述冷凍保存4周后各組坐骨神經(jīng)各8條，另隨即取Sprague-Dawley大鼠新鮮神經(jīng)8條作為新鮮對照組(E組)，截成3 mm長小段，置于6孔培養(yǎng)板中，每孔中加入DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS，1%雙抗)2.5 ml，每組5個培養(yǎng)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)7 d，每2天換液1次。按照上述Western blotting法檢測NGF、GDNF蛋白表達，β-actin作為內(nèi)參，生物學(xué)重復(fù)為6次。

1.4.5 同種異體神經(jīng)移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)

采用免疫組化染色觀察免疫排斥反應(yīng)。移植后4周，大鼠2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，于右股后外側(cè)縱行切口，截取大鼠移植神經(jīng)中段，4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，縱切4 μm；二甲苯脫蠟后水化，抗原修復(fù)，血清封閉，CD4一抗孵育過夜，滴加二抗，辣根酶標，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，碳酸鋰返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察CD4陽性T淋巴細胞入侵移植物情況。

每組選取6只大鼠，2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，心臟取血，靜置1 h后，3000 r/min離心15 min，取上清。血清IL-6、IFN-γ水平根據(jù)ELISA試劑盒說明書測定。

1.4.6 同種異體神經(jīng)移植術(shù)后電生理檢測

術(shù)后20周，各組選取6只大鼠，10%水合氯醛4 ml/kg腹腔麻醉，于右股后外側(cè)縱行切口，沿肌間隙鈍性分離，暴露、游離移植側(cè)坐骨神經(jīng)，于梨狀肌下緣3 mm處神經(jīng)干上放置刺激電極，同側(cè)外踝關(guān)節(jié)上10 mm腓腸肌上安置接收電極，地線遠離兩電極接地，刺激強度1 V，刺激間隙0.25 ms。用BL-420F系統(tǒng)測定肌肉復(fù)合動作電位(compound muscle action potential,CMAP)和運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity,MNCV)。

1.4.7 同種異體神經(jīng)移植術(shù)后組織學(xué)分析

電生理檢測后，截取大鼠移植神經(jīng)中段8 mm，2%戊二醛4℃固定過夜，1%鋨酸固定2 h，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋。

半薄切片，甲苯胺藍染色，CCD光譜測量系統(tǒng)，每張切片隨機取6個視野統(tǒng)計，以Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，分析再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)目和髓鞘厚度。

每組另取兩個樣本，超薄切片、醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察再生神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0進行分析。數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)處理后神經(jīng)CIRP mRNA及蛋白水平

4組CIRP mRNA表達有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，C組表達最高，B組表達最低，A組次之。4組CIRP蛋白表達有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，C組表達最高，B組表達最低，A組次之，但A組和B組間無顯著性差異(P＞0.05)。見圖1、表2。

圖1 不同溫度預(yù)處理后坐骨神經(jīng)CIRP蛋白表達(Western blotting)

2.2 坐骨神經(jīng)冷凍保存后觀察

2.2.1 Calcein-AM/PI熒光染色

E組神經(jīng)纖維綠色熒光強、分布廣泛，基本沒有紅色熒光；A組、B組、C組和D組液氮保存4周后，仍可見神經(jīng)纖維較強綠色熒光，但熒光強度較E組弱，且紅色熒光較E組明顯多，但C組紅色熒光明顯較A組、B組和D組弱。見圖2。

2.2.2 冷凍保存神經(jīng)Bax、Bcl-2蛋白表達

4組間Bax蛋白表達均有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，C組表達低于A組、B組和D組(P＜0.05)，A組和B組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表3、圖3。

4組間Bcl-2蛋白表達均有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，C組表達高于A組、B組和D組(P＜0.05)，B組高于A組(P＜0.05)。見表3、圖3。

表2 各組預(yù)處理后CIRPmRNA及蛋白水平

圖2 Calcein-AM/PI熒光染色激光共聚焦顯微鏡觀察(400×，bar=50μm)

2.2.3冷凍保存神經(jīng)分泌NGF、GDNF蛋白表達

坐骨神經(jīng)體外培養(yǎng)7 d，均可檢測到NGF及GDNF表達。與E組相比，C組表達升高(P＜0.05)，A組、B組和D組表達降低(P＜0.05)。與D組相比，A組、B組NGF蛋白表達降低(P＜0.05)；A組、B組GDNF蛋白無顯著性差異(P＞0.05)。C組NGF及GDNF蛋白表達均高于其他組(P＜0.05)。見表4、圖4。

表3 各組冷凍保存神經(jīng)Bax、Bcl-2蛋白水平

圖3 冷凍保存神經(jīng)Bax、Bcl-2蛋白表達(Western blotting)

圖4 冷凍保存神經(jīng)分泌NGF、GDNF蛋白表達(Western blotting)

2.3 同種異體神經(jīng)移植后檢測

2.3.1 免疫排斥反應(yīng)

術(shù)后4周，F(xiàn)′組CD4+T淋巴細胞較少，E′組最多，各預(yù)處理組中，C′組較A′組、B′組及D′組相對較少(圖5)。ELISA結(jié)果顯示，F(xiàn)′組血清中IL-6、IFN-γ水平最低，E′組最高(P＜0.001)；與 E′組相比，C′組 IL-6、IFN-γ水平降低(P＜0.05)，并且在各個預(yù)處理移植組中，F(xiàn)′組IL-6、IFN-γ水平最低(P＜0.05)；C′組與D′組和F′組比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表5。

表4 各組冷凍保存神經(jīng)分泌NGF、GDNF蛋白水平

表5 各組術(shù)后4周各組大鼠血清IL-6、IFN-γ水平

2.3.2 電生理檢測

移植術(shù)后20周，所有組間CMAP、MNCV均有非常高度顯著性差異(P＜0.001)。F′組CMAP、MNCV優(yōu)于其他組(P＜0.05)；C′組優(yōu)于A′組、B′組、D′組和E′組(P＜0.05)；與 D′組相比，A′組無明顯變化(P＞0.05)，B′組降低(P＜0.05)。見表6。

2.3.3 組織學(xué)分析

移植后20周，F(xiàn)′組髓鞘厚度優(yōu)于其他組(P＜0.05)，C′組優(yōu)于 A′組、B′組、D′組和 E′組(P＜0.05)。見圖6、表7。

移植后20周，電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)顯示，F(xiàn)′組和C′組可見大量有髓神經(jīng)纖維，纖維粗細均勻，髓鞘厚；D′組再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量較多，分布廣泛、髓鞘較厚；A′組及B′組再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量較少，分布較廣泛，髓鞘較薄；E′組再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量少，直徑較細，分布稀疏，髓鞘薄，可見明顯結(jié)蹄組織增生。見圖7。

圖5 術(shù)后4周移植段神經(jīng)淋巴細胞入侵(免疫組化染色，100×，bar=200μm)

圖6 術(shù)后20周移植神經(jīng)中段甲苯胺藍染色(400×，bar=50μm)

圖7 各組術(shù)后20周移植中段再生神經(jīng)電鏡超微結(jié)構(gòu)(6000×，bar=10μm)

表6 各組術(shù)后20周肌肉CMAP和MNCV比較

表7 各組術(shù)后20周軸突密度和髓鞘厚度比較

3 討論

由于自體神經(jīng)移植無法滿足臨床周圍神經(jīng)長段缺損修復(fù)需要，同種異體神經(jīng)具有自體神經(jīng)相同的組織結(jié)構(gòu)特點，最有可能成為自體神經(jīng)的替代物。周圍神經(jīng)深低溫保存可以為臨床提供神經(jīng)缺損修復(fù)所需要的神經(jīng)移植物，但是低溫保存時滲透壓的改變、冰晶形成、缺血缺氧等變化，會造成被保存組織的細胞(包括周圍神經(jīng)SCs)嚴重損傷[7-9]。SCs是周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細胞，能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子和黏附分子，對周圍神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生具有非常重要的作用，缺乏SCs的神經(jīng)修復(fù)材料，不利于修復(fù)后的神經(jīng)再生。

CIRP是首個在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)的冷休克蛋白，對冷誘導(dǎo)下細胞生長及凋亡具有調(diào)控作用[10]。同時，是亞低溫時對腦、心、肝臟等組織器官起低溫保護作用的溫度依賴性關(guān)鍵調(diào)控蛋白，在細胞受到低溫、缺氧、紫外線、滲透壓變化等因素刺激時，表達會升高[11]。研究表明，在哺乳動物細胞中，CIRP在輕度至中度低溫(28～34℃)時達到高峰，低溫(15～25℃)時則顯著下降；在熱刺激(39～42℃)下表達顯著降低[12]。

本實驗結(jié)果顯示，大鼠坐骨神經(jīng)在不同溫度預(yù)處理24 h后，32℃預(yù)處理后CIRP表達明顯升高；用不同溫度預(yù)處理24 h的大鼠坐骨神經(jīng)冷凍保存4周，CIRP高表達提高了冷凍保存神經(jīng)的活細胞數(shù)量。此外，32℃預(yù)處理后，Bcl-2表達升高，Bax蛋白降低。有研究表明，細胞凋亡是一個受多種因素調(diào)控的復(fù)雜過程，尤其是Bcl-2和Bax，在調(diào)節(jié)細胞分化和神經(jīng)元存活中發(fā)揮作用。Bcl-2能夠防止由于紫外線、自由基、生長因子缺乏等各種應(yīng)激引起的細胞凋亡；相反，Bax誘導(dǎo)細胞死亡[13]。這些發(fā)現(xiàn)提示CIRP通過激活Bcl-2和抑制Bax，在冷凍保存過程中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

SCs作為周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)與功能細胞，能釋放多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，如NGF、GDNF，這些生長因子在周圍神經(jīng)損傷后，對神經(jīng)細胞的存活、軸突的生長和走向起著十分重要的營養(yǎng)和誘導(dǎo)作用[14-16]。另外，有研究報道，GDNF通過上調(diào)Bcl-2和抑制Bax來保護神經(jīng)細胞免于凋亡[17]。本實驗結(jié)果顯示，將冷凍保存后的坐骨神經(jīng)于體外培養(yǎng)1周，32℃預(yù)處理后NGF和GDNF高表達，表明SCs在冷凍保存后仍具有分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的生物學(xué)活性，這可能與Bax/Bcl-2途徑密切相關(guān)。

免疫排斥反應(yīng)是同種異體移植面臨的又一大問題，可能對神經(jīng)再生及功能恢復(fù)造成不利的影響?；罨腃D4+T淋巴細胞通過釋放炎癥因子IL-6、IFN-γ等[18]，介導(dǎo)免疫排斥反應(yīng)。Li等[19]發(fā)現(xiàn)，CD4+T淋巴細胞水平升高會損傷移植后的器官。本實驗結(jié)果顯示，與新鮮同種異體移植相比，冷凍保存后同種異體移植的CD4+T淋巴細胞入侵及血清IL-6、IFN-γ水平較低，尤其是32℃預(yù)處理的同種異體移植后。據(jù)報道，冷凍保存可以降低同種異體移植排斥反應(yīng)[20-21]；此外，CIRP的缺乏將加速炎癥反應(yīng)、延長傷口愈合過程[22]。本實驗結(jié)果與此一致，這表明CIRP的高表達以及冷凍保存降低了同種異體移植后的免疫排斥反應(yīng)。

移植術(shù)后20周，與4℃同種異體移植、15℃同種異體移植、冷凍處理新鮮同種異體移植相比，32℃同種異體移植后再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量較多，分布廣泛、髓鞘較厚；肌肉CMAP高，MNCV快。據(jù)報道，神經(jīng)損傷后，隨著時間推移，其支配的靶肌肉將發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的萎縮，并失去功能，其功能恢復(fù)與神經(jīng)軸突的再生密切相關(guān)[23-24]。MNCV與髓鞘厚度有關(guān)，而髓鞘厚度是再生纖維成熟程度的反映。再生纖維的傳導(dǎo)速度能否完全恢復(fù)正常，很大程度上取決于髓鞘厚度的恢復(fù)[25-26]。因此，本實驗通過CIRP的誘導(dǎo)表達，提高了冷凍保存后神經(jīng)的生物活性，同種異體移植后通過增加再生神經(jīng)軸突的厚度和密度，進而促進坐骨神經(jīng)的功能恢復(fù)。

綜上所述，大鼠坐骨神經(jīng)32℃亞低溫預(yù)處理，通過誘導(dǎo)坐骨神經(jīng)CIRP高表達，能夠抑制冷凍保存過程中細胞凋亡，維持保存后神經(jīng)SCs的生物活性，有利于SCs分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，并可減弱移植后免疫排斥反應(yīng)，從而改善異體移植后受體神經(jīng)的再生效果以及功能恢復(fù)，這可為周圍神經(jīng)損傷治療提供新的思路。我們將進一步探討關(guān)于CIRP在坐骨神經(jīng)再生中更為詳細的分子機制。

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