周韓玲,廖勤儉,安明哲,李楊華,郭 艷
(四川宜賓五糧液股份有限公司技術(shù)研究中心,四川宜賓644007)
γ-氨基丁酸,簡(jiǎn)稱(chēng)GABA,是一種廣泛分布于動(dòng)植物、微生物體內(nèi)的非蛋白動(dòng)能性氨基酸。它參與多種代謝活動(dòng),具有很高的生理活性,是神經(jīng)中樞重要的抑制性氨基酸遞質(zhì)。醫(yī)學(xué)上,可用于肝昏迷及腦代謝障礙,還可以抗神經(jīng)不安,是對(duì)抗抑郁焦慮、改善情緒、緩解壓力、促進(jìn)睡眠、提高腦活動(dòng)、解毒醒酒的一種純天然物質(zhì),也是一種新型的功能因子。
隨著業(yè)界對(duì)γ-氨基丁酸研究的深入,微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-氨基丁酸已經(jīng)成為研究熱點(diǎn),如乳酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的研究[1]。大曲是糧食原料網(wǎng)羅自然微生物自然發(fā)酵而成,其中含有豐富的微生物、酶系及發(fā)酵產(chǎn)物,是釀造白酒的糖化發(fā)酵劑,同時(shí),對(duì)白酒香味成分也有很大的貢獻(xiàn)。γ-氨基丁酸主要來(lái)源于L-谷氨酸的脫羧反應(yīng),由此,研究檢測(cè)大曲中的L-谷氨酸和γ-氨基丁酸含量,對(duì)研究大曲中代謝γ-氨基丁酸的微生物以及釀酒發(fā)酵過(guò)程中L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的生成變化,具有一定的指導(dǎo)意義。
此前的文獻(xiàn)資料中,對(duì)γ-氨基丁酸的檢測(cè)也有報(bào)道,如利用高效液相色譜、柱前衍生、紫外檢測(cè)方式來(lái)測(cè)定發(fā)芽糙米中的γ-氨基丁酸,其中γ-氨基丁酸的提取方式為乙醇水混合溶液回流萃提[2];測(cè)定腦脊液中谷氨酸和γ-氨基丁酸,同樣采取紫外檢測(cè)方式,其中目標(biāo)物的提取方式也比較復(fù)雜[3]。紫外檢測(cè)器選擇性較低,對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品,在色譜定性和定量上會(huì)出現(xiàn)不準(zhǔn)確。針對(duì)大曲樣品中復(fù)雜的化學(xué)成分,通過(guò)自動(dòng)柱前衍生方式,利用熒光檢測(cè)器進(jìn)行L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的檢測(cè),其優(yōu)勢(shì)在于樣品無(wú)需復(fù)雜的前處理,靈敏度高,穩(wěn)定性、重復(fù)性好。
樣品:釀酒生產(chǎn)用大曲。
儀器設(shè)備:美國(guó)Agilent公司1100系列高效液相色譜儀(HPLC),F(xiàn)LD檢測(cè)器,離心機(jī),振蕩器。
耗材:L-谷氨酸和γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品,自購(gòu)。
分析柱:Agilent HypersilAA-ODS 2.1×200 mm 5-micron。
流動(dòng)相:A,甲醇(色譜級(jí));D,20 mmol乙酸鈉,0.018%三乙胺調(diào)pH7.2后,加入0.3%的四氫呋喃。
梯度洗脫:0~2 min,100 D~100 D;25 min,65 D;30 min,0 D;35 min,0 D;36 min,100 D;40 min,100 D;40 min,stop。
柱溫:30 ℃;流速:0.4 mL/min。進(jìn)樣程序:抽取5.0 μL緩沖液。
從樣品瓶抽取1.0 μL;將6.0 μL混合到空氣,最大速度,2次;抽取0 μL水洗針液;抽取1.0 μL的OPA衍生試劑;將6.0 μL混合到空氣中,最大速度,6次;抽取0 μL水洗針液;抽取64 μL水;將36 μL混合到空氣,最大速度,2次;進(jìn)樣。
精確稱(chēng)取γ-氨基丁酸和L-谷氨酸,以0.1 mol/L的HCl水溶液配制成50 mL濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,放置于4℃下冷藏。
稱(chēng)取5份粉碎后的大曲粉末(每份1.00 g),分別置于5支15 mL離心管中,向第1支離心管中加入10 mL甲醇,第2支離心管中加入10 mL 75%甲醇水溶液,第3支離心管中加入10 mL50%甲醇水溶液,第4支離心管中加入10 mL 25%甲醇水溶液,第5支離心管中加入10 mL 0.1 mol/L的HCl水溶液,每支離心管振蕩提取10 min,離心,取上清液0.1mL,用0.1 mol/L的HCl水溶液稀釋至1 mL,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)液相色譜儀分析。
取1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,0.1 mol/L的HCl水溶液稀釋至濃度為2.0 mg/L,進(jìn)行定性檢測(cè),L-谷氨酸出峰時(shí)間為2.2 min,γ-氨基丁酸出峰時(shí)間為22.2 min。大曲樣品處理方式見(jiàn)1.5,標(biāo)樣色譜圖見(jiàn)圖1,樣品色譜圖見(jiàn)圖2。
圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖
圖2 樣品色譜圖
取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,0.1 mol/L的HCl水溶液稀釋至 120 μg/L、360 μg/L、1200 μg/L、3600 μg/L、12000 μg/L共5個(gè)濃度梯度,作為定量分析校正。以峰面積Y為縱坐標(biāo),以質(zhì)量濃度(μg/L)為X橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明,在120~12000 μg/L范圍內(nèi),線性相關(guān)系數(shù)較好,能準(zhǔn)確定量分析大曲中L-谷氨酸與γ-氨基丁酸含量。回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)及方法定量限見(jiàn)表1。
表1 方法回歸方程、相關(guān)系數(shù)及定量限
表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
采用不同方法提取曲粉中的L-谷氨酸與γ-氨基丁酸,結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。
圖3 不同方法提取曲藥中L-谷氨酸結(jié)果(μg/L)
圖4 不同方法提取曲藥中γ-氨基丁酸結(jié)果(μg/L)
從圖3、圖4可看出,采用甲醇作為提取液時(shí),曲藥中氨基酸提取率較低,采用甲醇水溶液和0.1 moL/L HCl作為提取液時(shí),效果明顯好于純甲醇,當(dāng)甲醇水溶液濃度為75%時(shí),曲藥中L-谷氨酸及γ-氨基丁酸提取率最高,加之甲醇濃度越高,曲藥浸泡液中糖類(lèi)物質(zhì)越少,對(duì)氨基酸檢測(cè)干擾也越小,所以,最后選擇75%甲醇水溶液作為提取液。
采用75%甲醇水溶液作為提取液,提取曲粉中L-谷氨酸與γ-氨基丁酸,對(duì)同一樣品平行測(cè)定6次,得到γ-氨基丁酸的檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.59%~1.72%,滿(mǎn)足分析要求,結(jié)果見(jiàn)表2。
取大曲樣品3份,采用75%甲醇水溶液作為提取液,其中1份作為空白本底值,另外2份大曲稱(chēng)入離心管后,在離心管中分別加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行回收率試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明,化合物的回收率為90.96%~101.49%,滿(mǎn)足分析要求,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 樣品中加標(biāo)回收率結(jié)果
采用75%甲醇水溶液作為提取液,曲藥中L-谷氨酸與γ-氨基丁酸提取率較高,所建立檢測(cè)方法的R2值、精密度、加標(biāo)回收率等均較好,能準(zhǔn)確分析大曲樣品中的L-谷氨酸和γ-氨基丁酸含量。大曲樣品經(jīng)75%甲醇水溶液振蕩提取,提取液中有機(jī)相較高,能抑制大曲中的酶促反應(yīng),離心后的上清液如需隔夜檢測(cè),需要冷藏放置。
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