周韓玲，廖勤儉，安明哲，李楊華，郭 艷

(四川宜賓五糧液股份有限公司技術(shù)研究中心，四川宜賓644007)

γ-氨基丁酸，簡(jiǎn)稱(chēng)GABA，是一種廣泛分布于動(dòng)植物、微生物體內(nèi)的非蛋白動(dòng)能性氨基酸。它參與多種代謝活動(dòng)，具有很高的生理活性，是神經(jīng)中樞重要的抑制性氨基酸遞質(zhì)。醫(yī)學(xué)上，可用于肝昏迷及腦代謝障礙，還可以抗神經(jīng)不安，是對(duì)抗抑郁焦慮、改善情緒、緩解壓力、促進(jìn)睡眠、提高腦活動(dòng)、解毒醒酒的一種純天然物質(zhì)，也是一種新型的功能因子。

隨著業(yè)界對(duì)γ-氨基丁酸研究的深入，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-氨基丁酸已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，如乳酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的研究[1]。大曲是糧食原料網(wǎng)羅自然微生物自然發(fā)酵而成，其中含有豐富的微生物、酶系及發(fā)酵產(chǎn)物，是釀造白酒的糖化發(fā)酵劑，同時(shí)，對(duì)白酒香味成分也有很大的貢獻(xiàn)。γ-氨基丁酸主要來(lái)源于L-谷氨酸的脫羧反應(yīng)，由此，研究檢測(cè)大曲中的L-谷氨酸和γ-氨基丁酸含量，對(duì)研究大曲中代謝γ-氨基丁酸的微生物以及釀酒發(fā)酵過(guò)程中L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的生成變化，具有一定的指導(dǎo)意義。

此前的文獻(xiàn)資料中，對(duì)γ-氨基丁酸的檢測(cè)也有報(bào)道，如利用高效液相色譜、柱前衍生、紫外檢測(cè)方式來(lái)測(cè)定發(fā)芽糙米中的γ-氨基丁酸，其中γ-氨基丁酸的提取方式為乙醇水混合溶液回流萃提[2]；測(cè)定腦脊液中谷氨酸和γ-氨基丁酸，同樣采取紫外檢測(cè)方式，其中目標(biāo)物的提取方式也比較復(fù)雜[3]。紫外檢測(cè)器選擇性較低，對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，在色譜定性和定量上會(huì)出現(xiàn)不準(zhǔn)確。針對(duì)大曲樣品中復(fù)雜的化學(xué)成分，通過(guò)自動(dòng)柱前衍生方式，利用熒光檢測(cè)器進(jìn)行L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的檢測(cè)，其優(yōu)勢(shì)在于樣品無(wú)需復(fù)雜的前處理，靈敏度高，穩(wěn)定性、重復(fù)性好。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

樣品：釀酒生產(chǎn)用大曲。

儀器設(shè)備：美國(guó)Agilent公司1100系列高效液相色譜儀(HPLC)，F(xiàn)LD檢測(cè)器，離心機(jī)，振蕩器。

耗材：L-谷氨酸和γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，自購(gòu)。

1.2 色譜條件

分析柱：Agilent HypersilAA-ODS 2.1×200 mm 5-micron。

流動(dòng)相：A，甲醇（色譜級(jí)）；D，20 mmol乙酸鈉，0.018%三乙胺調(diào)pH7.2后，加入0.3%的四氫呋喃。

梯度洗脫：0～2 min，100 D～100 D；25 min，65 D；30 min，0 D；35 min，0 D；36 min，100 D；40 min，100 D；40 min，stop。

柱溫：30 ℃；流速：0.4 mL/min。進(jìn)樣程序：抽取5.0 μL緩沖液。

從樣品瓶抽取1.0 μL；將6.0 μL混合到空氣，最大速度，2次；抽取0 μL水洗針液；抽取1.0 μL的OPA衍生試劑；將6.0 μL混合到空氣中，最大速度，6次；抽取0 μL水洗針液；抽取64 μL水；將36 μL混合到空氣，最大速度，2次；進(jìn)樣。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

精確稱(chēng)取γ-氨基丁酸和L-谷氨酸，以0.1 mol/L的HCl水溶液配制成50 mL濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放置于4℃下冷藏。

1.4 樣品處理

稱(chēng)取5份粉碎后的大曲粉末（每份1.00 g），分別置于5支15 mL離心管中，向第1支離心管中加入10 mL甲醇，第2支離心管中加入10 mL 75%甲醇水溶液，第3支離心管中加入10 mL50%甲醇水溶液，第4支離心管中加入10 mL 25%甲醇水溶液，第5支離心管中加入10 mL 0.1 mol/L的HCl水溶液，每支離心管振蕩提取10 min，離心，取上清液0.1mL，用0.1 mol/L的HCl水溶液稀釋至1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)液相色譜儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)樣和樣品的定性檢測(cè)

取1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.1 mol/L的HCl水溶液稀釋至濃度為2.0 mg/L，進(jìn)行定性檢測(cè)，L-谷氨酸出峰時(shí)間為2.2 min，γ-氨基丁酸出峰時(shí)間為22.2 min。大曲樣品處理方式見(jiàn)1.5，標(biāo)樣色譜圖見(jiàn)圖1，樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，0.1 mol/L的HCl水溶液稀釋至 120 μg/L、360 μg/L、1200 μg/L、3600 μg/L、12000 μg/L共5個(gè)濃度梯度，作為定量分析校正。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（μg/L）為X橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，在120～12000 μg/L范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)較好，能準(zhǔn)確定量分析大曲中L-谷氨酸與γ-氨基丁酸含量。回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)及方法定量限見(jiàn)表1。

表1 方法回歸方程、相關(guān)系數(shù)及定量限

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 樣品中氨基酸提取方法優(yōu)化結(jié)果

采用不同方法提取曲粉中的L-谷氨酸與γ-氨基丁酸，結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 不同方法提取曲藥中L-谷氨酸結(jié)果（μg/L）

圖4 不同方法提取曲藥中γ-氨基丁酸結(jié)果（μg/L）

從圖3、圖4可看出，采用甲醇作為提取液時(shí)，曲藥中氨基酸提取率較低，采用甲醇水溶液和0.1 moL/L HCl作為提取液時(shí)，效果明顯好于純甲醇，當(dāng)甲醇水溶液濃度為75%時(shí)，曲藥中L-谷氨酸及γ-氨基丁酸提取率最高，加之甲醇濃度越高，曲藥浸泡液中糖類(lèi)物質(zhì)越少，對(duì)氨基酸檢測(cè)干擾也越小，所以，最后選擇75%甲醇水溶液作為提取液。

2.4 精密度試驗(yàn)

采用75%甲醇水溶液作為提取液，提取曲粉中L-谷氨酸與γ-氨基丁酸，對(duì)同一樣品平行測(cè)定6次，得到γ-氨基丁酸的檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.59%～1.72%，滿(mǎn)足分析要求，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取大曲樣品3份，采用75%甲醇水溶液作為提取液，其中1份作為空白本底值，另外2份大曲稱(chēng)入離心管后，在離心管中分別加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行回收率試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物的回收率為90.96%～101.49%，滿(mǎn)足分析要求，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品中加標(biāo)回收率結(jié)果

3 結(jié)論

采用75%甲醇水溶液作為提取液，曲藥中L-谷氨酸與γ-氨基丁酸提取率較高，所建立檢測(cè)方法的R2值、精密度、加標(biāo)回收率等均較好，能準(zhǔn)確分析大曲樣品中的L-谷氨酸和γ-氨基丁酸含量。大曲樣品經(jīng)75%甲醇水溶液振蕩提取，提取液中有機(jī)相較高，能抑制大曲中的酶促反應(yīng)，離心后的上清液如需隔夜檢測(cè)，需要冷藏放置。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉清,姚慧媛,張暉.生產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].氨基酸和生物資源,2004(1)：40-43.

[2]房克敏,李再貴,袁漢成,等.HPLC法測(cè)定發(fā)芽糙米中的γ-氨基丁酸含量[J].食品科學(xué),2006(4)：208-211.

[3]陳希賢,李東,呂建新,等.高效液相色譜法測(cè)定人腦脊液中γ-氨基丁酸和谷氨酸[J].色譜,1997(3)：237-239.