宋衛(wèi)得，李兆杰，劉 冰，姜維珍，葉佳宇，李林杰，李 健

（1.日照出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東日照276826； 2.威海出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東威海264200）

有機(jī)酸是酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，葡萄酒中主要有機(jī)酸有乳酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、檸檬酸、甲酸、丁酸等[1]，有機(jī)酸的種類(lèi)和含量影響著葡萄酒的色澤、口感、生物穩(wěn)定性；葡萄酒中有毒有害陰離子超標(biāo)時(shí)，就會(huì)危害人體健康；有機(jī)酸含量測(cè)定還可監(jiān)控生產(chǎn)、識(shí)別質(zhì)量、辨別摻假等[2]。因此，建立葡萄酒中多種有機(jī)酸和陰離子同時(shí)檢測(cè)的方法，對(duì)于葡萄酒釀制過(guò)程質(zhì)量控制和產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控具有重要的實(shí)用價(jià)值。

離子色譜法具有高效、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[3-8]，是同時(shí)測(cè)定有機(jī)酸和陰離子的理想方法。潘丙珍等[9]采用離子色譜法測(cè)定了酒中16種有機(jī)酸，但是存在基線(xiàn)不平穩(wěn)、檢測(cè)組分較少等不足；吳飛燕等[10]采用離子色譜法建立了酒中17種有機(jī)酸同時(shí)檢測(cè)的方法，靈敏度高，但僅分析了有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)，需52 min后才能全部出峰。目前離子色譜法測(cè)定葡萄酒中多種有機(jī)酸和陰離子的方法研究較少，且存在分析組分少、影響因素考察不全、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)等不足。本研究采用多級(jí)梯度淋洗離子色譜法，分析實(shí)驗(yàn)影響因素，優(yōu)化色譜分離條件，建立了同時(shí)測(cè)定葡萄酒中26種有機(jī)酸和陰離子的方法，26種組分在32 min內(nèi)即可全部出峰，實(shí)現(xiàn)了快速分析、綠色分析、多組分同時(shí)分析的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

酒樣：國(guó)產(chǎn)、進(jìn)口的紅白葡萄酒，市售。

儀器：離子色譜儀（Dionex ICS2100），配備電導(dǎo)檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器（AS-DV）；自動(dòng)再生抑制器（ASRS 300）；Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

試劑：超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）；8種陰離子標(biāo)準(zhǔn)溶液（濟(jì)南眾標(biāo)科技有限公司），質(zhì)量濃度為1000 mg/L；18種有機(jī)酸均為優(yōu)級(jí)純以上級(jí)別試劑，使用時(shí)配成所需的質(zhì)量濃度。

1.2 離子色譜條件

陰離子分離柱：Dionex IonPacTMAS11-HC；保護(hù)柱：Dionex IonPacTMAG11-HC；抑制器再生模式：外加水電導(dǎo)抑制，電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)；流動(dòng)相：KOH梯度淋洗液；流速：1.00 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：50 μL。

1.3 前處理步驟

采用濃度為2.0 mol/L的KOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至5.3～6.0，取10 mL樣品放入50 mL離心管中，移取上清液樣品1.0 mL，用超純水定容至100 mL容量瓶中，搖勻、靜置10 min，取10.0 mL溶液，過(guò)0.22 μm水相濾膜，棄去前面3 mL，收集后面清液，待上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱的選擇

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，先后進(jìn)行了AS11-HC、AS11、AS19共3種色譜柱的分析對(duì)比實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用AS11-HC色譜柱時(shí)多數(shù)組分峰型較尖銳、靈敏度較好。這是因?yàn)锳S11-HC是一種高容量、強(qiáng)親水性色譜柱，尤其適用于食品中多種有機(jī)酸和陰離子同時(shí)測(cè)定。因此，選擇AS11-HC色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

2.1.2 流速的選擇

分別進(jìn)行了0.50 mL/min、0.75 mL/min、1.00 mL/min、1.25 mL/min、1.50 mL/min 5個(gè)流速條件下的實(shí)驗(yàn)對(duì)比。在0.50 mL/min和0.75 mL/min流速時(shí)，因流速低，壓力小，峰寬較大，總出峰時(shí)間較長(zhǎng)，靈敏度不高。1.25 mL/min和1.50 mL/min流速時(shí)系統(tǒng)壓力不斷升高，壓力過(guò)大易損害色譜柱的固定相，從而極大影響色譜柱使用壽命。在1.00 mL/min時(shí)，壓力大小適中，靈敏度高，總出峰時(shí)間縮至32 min。綜合考慮各種影響因素，實(shí)驗(yàn)流速選擇1.00 mL/min。

2.1.3 pH值的選擇

首先進(jìn)行了0.01～10.0 mg/L濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的pH值測(cè)定實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液中組分濃度由0.01增至10.0 mg/L時(shí)，溶液中H+濃度增大，溶液酸性逐漸增大，pH值由5.47降為3.52。

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)組分中，存在一些不穩(wěn)定的弱酸和有機(jī)酸，如ClO2-和NO2-離子，受到溶液pH值影響較大，pH值小于4.0時(shí)，ClO2-和NO2-離子檢測(cè)濃度低于理論濃度的80%，這正是與溶液中高濃度的H+發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生的損失。本實(shí)驗(yàn)使用KOH溶液來(lái)調(diào)節(jié)一系列不同pH值的去離子水溶液為溶劑，而后配制不同pH值的同一理論濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)而測(cè)定26種組分在不同pH值時(shí)測(cè)定含量的變化。結(jié)果表明，弱酸和不穩(wěn)定有機(jī)酸在強(qiáng)酸性條件下受影響較大，而在pH5.5～7.0時(shí)，多數(shù)組分檢測(cè)含量穩(wěn)定、變化小。這是因?yàn)槎鄶?shù)有機(jī)酸的解離常數(shù)pKa值在4.2～6.9，當(dāng)pH值與pKa值相等時(shí)，溶液中的離子型分子和中性分子的濃度相同，組分處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，便于定量分析。

考慮到葡萄酒的pH值一般在2.7～4.0范圍，而pH值大小又直接影響著某些弱酸和不穩(wěn)定有機(jī)酸的電離程度，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，稀釋100倍后酒類(lèi)樣品的pH值處于4.5～6.0，考慮到中性或弱酸性環(huán)境下，標(biāo)準(zhǔn)溶液和測(cè)定樣品中多數(shù)組分處于含量穩(wěn)定狀態(tài)，因此，本次實(shí)驗(yàn)選取標(biāo)準(zhǔn)溶液配制至pH值為5.3～6.0之間。

2.1.4 梯度淋洗條件的選擇

本試驗(yàn)一次性測(cè)定多種組分，而個(gè)別組分結(jié)構(gòu)性能類(lèi)似、分子量相近，普通淋洗濃度梯度條件，難以保證26種組分的有效分離。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和各種組分的色譜柱保留特性，將26種組分分為3類(lèi)：弱保留組分（1～13）、中等保留組分（14～21）、強(qiáng)保留組分（22～26）。首先，0～6 min為初始淋洗濃度時(shí)間段，分別進(jìn)行了0.80 mmol/L、1.00 mmol/L、1.25 mmol/L初始濃度時(shí)的實(shí)驗(yàn)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在0.80 mmol/L初始濃度下，各組分出峰時(shí)間拖后，總出峰時(shí)間延長(zhǎng)，且前3種弱保留組分的分離度不理想；1.25 mmol/L初始濃度時(shí)，前10種弱保留組分分離效果不好；初始濃度1.00 mmol/L時(shí)，多數(shù)組分色譜峰的分離狀況較理想。因此，選擇1.00 mmol/L為初始淋洗濃度。

6～22 min時(shí)，出峰組分有21種，在實(shí)驗(yàn)時(shí)最初選擇使用了2次淋洗濃度變化，但此時(shí)難以確保21種組分的有效分離。前后進(jìn)行了30多次實(shí)驗(yàn)分析對(duì)比，最終選擇了使用3次淋洗濃度和淋洗斜率的變化，首先，在6～13 min時(shí)，淋洗濃度由1.0 mmol/L增至14.0 mmol/L，淋洗斜率為1.857 mmol/L·min；在13～17 min時(shí)，淋洗濃度由14.0 mmol/L增至14.5 mmol/L，此時(shí)基本是一個(gè)等度淋洗濃度，斜率只有0.125 mmol/L·min；在17～22 min時(shí)，選取淋洗斜率為0.700mmol/L·min，淋洗濃度由14.5mmol/L增至18.0 mmol/L。在此梯度淋洗條件下，21種組分靈敏度較高，分離效果理想。

在22～33 min時(shí)，進(jìn)行了最高淋洗濃度分別為50 mmol/L、60 mmol/L、70 mmol/L條件下對(duì)比分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，最高淋洗濃度為50 mmol/L時(shí)，淋洗濃度較低，5種強(qiáng)保留組分出峰時(shí)間拖后，且靈敏度不高；最高淋洗濃度為70 mmol/L時(shí)，5種組分出峰速度快，靈敏度較高，但分離度不高，且組分峰有重疊情況；最高淋洗濃度為60 mmol/L時(shí)，5種強(qiáng)保留組分靈敏度和分離度較好，因此，選擇60 mmol/L為最高淋洗濃度。

總之，初始濃度的選擇、淋洗斜率大小、最高淋洗濃度的選擇及時(shí)間段的劃分都是影響多組分分離測(cè)定效果的重要因素。通過(guò)科學(xué)系統(tǒng)的研究，綜合分析各種實(shí)驗(yàn)影響因素，實(shí)現(xiàn)了32 min內(nèi)快速準(zhǔn)確測(cè)定葡萄酒中26種有機(jī)酸和陰離子的目標(biāo)。淋洗條件見(jiàn)表1，離子色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 離子色譜多級(jí)梯度淋洗條件

圖1 26種組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線(xiàn)性范圍與檢出限（表2）

進(jìn)行了26種有機(jī)酸和陰離子的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行校準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合。通過(guò)色譜峰信噪比來(lái)計(jì)算待測(cè)組分的檢出限（S/N=3），在0.01～1.00 mg/L濃度范圍內(nèi)，進(jìn)行了7個(gè)不同濃度水平（0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L）標(biāo)準(zhǔn)工作液的檢測(cè)和線(xiàn)性擬合。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，26種組分線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，除了F-外，其他7種無(wú)機(jī)陰離子相關(guān)系數(shù)均大于0.995，線(xiàn)性較好；個(gè)別有機(jī)酸由于分離度不夠或自身不穩(wěn)定，線(xiàn)性相關(guān)性不理想；總體來(lái)說(shuō)，26種組分線(xiàn)性均已達(dá)到食品理化定量技術(shù)要求。25種組分檢出限在0.00009～0.0783 mg/L之間，僅有苯甲酸檢出限為0.201 mg/L，本次實(shí)驗(yàn)的檢出限較前期研究時(shí)有所增大，主要是實(shí)驗(yàn)時(shí)色譜柱使用時(shí)間較長(zhǎng)，基線(xiàn)噪音有所增大的原因。

表2 測(cè)定組分的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限(S/N=3)

2.2.2 回收率與精密度

選取3種葡萄酒樣品，依次向3種樣品中添加濃度級(jí)別水平分別為0.10 mg/L、0.20 mg/L、1.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次平行測(cè)定實(shí)驗(yàn)，來(lái)驗(yàn)證方法的回收率和精密度。方法回收率和RSD數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

由表3可看出，在0.10 mg/L添加濃度水平下，回收率在75.97%～109.80%之間，RSD在0.22%～8.38%范圍內(nèi)；在0.20 mg/L添加濃度水平下，回收率在78.24%～107.25%之間，RSD在0.71%～8.06%范圍內(nèi)；在1.00 mg/L添加濃度水平下，回收率在80.59%～105.84%，RSD在0.78%～5.66%范圍。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，隨著添加濃度的增大，回收率和RSD數(shù)據(jù)范圍逐漸變小，準(zhǔn)確度和精密度漸趨穩(wěn)定。3個(gè)濃度水平下，苯甲酸的回收率在78.24%～81.30%之間，其中兩個(gè)濃度下RSD數(shù)據(jù)大于8.0%，主要因?yàn)楸郊姿崾请x子半徑較大、疏水性較強(qiáng)的有機(jī)酸，且自身不穩(wěn)定，因此色譜峰型不對(duì)稱(chēng)。順烏頭酸在0.10 mg/L和0.20 mg/L添加濃度水平下，回收率分別為75.97%和83.58%，這是因?yàn)轫槥躅^酸不夠穩(wěn)定，在一定條件下，有小部分轉(zhuǎn)化成反烏頭酸，表3中反烏頭酸回收率偏大也證實(shí)了這一點(diǎn)，但小部分的轉(zhuǎn)化并不影響定性定量分析，回收率和精密度依然滿(mǎn)足食品理化檢驗(yàn)技術(shù)要求。從總體上來(lái)看，3個(gè)濃度水平、6次平行檢測(cè)回收率數(shù)據(jù)結(jié)果比較理想，說(shuō)明葡萄酒中26種組分同時(shí)檢測(cè)的方法精密度高、穩(wěn)定性好。

2.2.3 準(zhǔn)確度

選取一種葡萄酒，添加0.50 mg/L濃度水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行3 d 9次平行測(cè)定實(shí)驗(yàn)。理論真值以基質(zhì)濃度和添加濃度相加來(lái)計(jì)，計(jì)算出9次測(cè)定值和理論真值的相對(duì)偏差。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，葡萄酒（0.50 mg/L）中26組分的9次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論真值的相對(duì)偏差在-15.09%～9.57%范圍內(nèi)，滿(mǎn)足食品理化準(zhǔn)確度技術(shù)要求，充分驗(yàn)證了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

表3 測(cè)定組分的回收率及精密度(RSD)(n=6)

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

選取5種代表性葡萄酒樣品（國(guó)產(chǎn)紅葡萄酒2種、進(jìn)口紅葡萄酒2種、進(jìn)口白葡萄酒1種），根據(jù)所選前處理方法和離子色譜條件，檢測(cè)了葡萄酒實(shí)際樣品中有機(jī)酸和陰離子含量。

由圖2可看出，葡萄酒中主要的有機(jī)酸有乳酸、乙酸、戊酸、戊二酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、檸檬酸、順烏頭酸、富馬酸、甲酸、丁酸等，無(wú)機(jī)陰離子有Cl-、NO3-、PO43-。僅有一個(gè)紅葡萄酒樣品中檢出微量 NO2-，有毒有害的 ClO2-、BrO3-、CrO42-陰離子均未檢出，說(shuō)明這些葡萄酒釀造所用原料質(zhì)量和水質(zhì)較好。從色譜圖中看出，除乳酸和乙酸組分濃度較高，分離度不理想，其他各種組分色譜峰尖銳，分離度較好，說(shuō)明方法的靈敏度好、穩(wěn)定性高。

從紅葡萄酒和白葡萄酒圖譜對(duì)比來(lái)看，紅葡萄酒中乳酸、戊酸、草酸的含量較高，而白葡萄酒中的琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、Cl-、NO3-、PO43-比紅葡萄酒中高，這主要因?yàn)榘灼咸丫剖怯冒灼咸鸦蛘呒t葡萄去皮和去核后壓榨、發(fā)酵而成，而紅葡萄酒卻是用紅葡萄連帶葡萄皮和果核釀制而成，原料和釀制方法的不同是白葡萄酒和紅葡萄酒的有機(jī)酸和陰離子含量不同的主要原因。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)色譜柱、流速、溶液pH值、初始梯度濃度等多種實(shí)驗(yàn)影響因素的分析，探索出適合葡萄酒中26種組分分離的梯度淋洗條件，建立了多級(jí)梯度淋洗-離子色譜法同時(shí)測(cè)定葡萄酒中26種有機(jī)酸和陰離子的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，流速為1.00 mL/min，柱溫為30℃，pH值在5.3～6.0之間時(shí)，26種組分的分離效果理想。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本方法主要優(yōu)點(diǎn)有：（1）一次性同時(shí)檢測(cè)26種組分，實(shí)現(xiàn)了有機(jī)酸、陰離子、防腐劑等多種類(lèi)組分同時(shí)檢測(cè)；（2）多因素多角度考察分析實(shí)驗(yàn)影響因素，有效提高了多組分檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性；（3）操作快速便捷、靈敏度高、適用性強(qiáng)，經(jīng)簡(jiǎn)單前處理后上機(jī)測(cè)定，32 min內(nèi)26種組分全部出峰。由此可見(jiàn)，該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，完全適于葡萄酒中26種有機(jī)酸和陰離子的分析測(cè)定。

圖2 5種葡萄酒樣品的離子色譜圖

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