李建民，韓素娜，晏 麗，楊方玉，喬艷明

（1.河南仰韶酒業(yè)有限公司，河南澠池472400； 2.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西漢中723000；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214000）

高級(jí)醇是一元醇中分子式含碳原子數(shù)大于2的一類(lèi)醇的統(tǒng)稱(chēng)，是白酒中重要的呈香物質(zhì)，它能夠增加白酒的協(xié)調(diào)感和飽滿(mǎn)感[1]。但在高度原漿酒降度過(guò)程中，高級(jí)醇是導(dǎo)致白酒出現(xiàn)白色渾濁物的主要原因，另外高級(jí)醇因碳鏈長(zhǎng)分子量大導(dǎo)致其在人體內(nèi)代謝緩慢，會(huì)促使人的大腦充血和神經(jīng)中毒，也就是人們俗稱(chēng)的“上頭”[2-3]。目前，國(guó)內(nèi)許多酒廠都在研究如何降低原漿酒中高級(jí)醇的含量，有關(guān)降低高級(jí)醇的研究一般通過(guò)優(yōu)化生產(chǎn)工藝、添加酶制劑和酵母等3種途徑。李長(zhǎng)文等[4]通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化蛋白酶、糖化酶和干酵母的添加量，高級(jí)醇在固態(tài)白酒中生成量降低48%；宗緒巖等[5]通過(guò)控制添加生物制劑的比例，使?jié)庀阈桶拙聘呒?jí)醇生成量降低21.06%；孫金旭[6]通過(guò)優(yōu)化糖化酶的添加量，使醬香型白酒的高級(jí)醇總含量降低了48.28%，而目前國(guó)內(nèi)有關(guān)陶融型白酒高級(jí)醇的研究尚無(wú)報(bào)道。

仰韶陶融型白酒作為我國(guó)第十三種香型白酒[7]，以其“醹、雅、融”的口感而被廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，而有關(guān)陶融型原漿酒中的高級(jí)醇研究還是空白。原漿酒在生產(chǎn)過(guò)程中高級(jí)醇主要是通過(guò)2條途徑產(chǎn)生，一是在酵母繁殖過(guò)程中分解氨基酸代謝形成的Ehrlich途徑，一是以葡萄糖為基質(zhì)的合成路線即Harrsi途徑[8-9]。本研究基于酵母Ehrlich代謝途徑，以河南仰韶酒廠自主分離的YSY16酵母菌株為試材，制備純種酵母麩曲，考察酒醅中麩曲的不同添加量對(duì)原漿酒中高級(jí)醇含量的影響，以期得到一種陶融型原漿酒中高級(jí)醇含量的有效調(diào)控方法，為仰韶陶融型白酒的生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

菌株：YSY16酵母菌，仰韶酒業(yè)釀酒微生物實(shí)驗(yàn)室（該菌株的分離、鑒定在參考文獻(xiàn)[7]中已發(fā)表，被鑒定為釀酒酵母）。

酒醅（河南仰韶酒業(yè)有限公司）：用取樣袋，從仰韶酒廠陶融車(chē)間獲取蒸餾過(guò)酒的酒醅。

1.1.2 主要試劑

試劑：乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇（GR，上海生物工程有限公司）。

60%乙醇溶液配制：精確量取色譜標(biāo)準(zhǔn)品乙醇60 mL，用超純?nèi)ルx子水定容至100 mL容量瓶。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別精確量取色譜標(biāo)準(zhǔn)品正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇各0.20 mL，用60%vol乙醇溶液定容至1000 mL容量瓶。

內(nèi)標(biāo)溶液配制：精確稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品乙酸正丁酯2.0 mL，用60%vol乙醇溶液定容至100 mL容量瓶。

1.1.3 儀器設(shè)備

Thermo Scientific Trace1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；MJX-250生化培養(yǎng)箱，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；eppendorf移液器，Eppendorf公司；12 L304不銹鋼蒸餾器，煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件[10-11]和樣品檢測(cè)

色譜柱：毛細(xì)管柱DB-FFAP（60.0 m×0.25 mm×0.25 mm）；程序升溫：起始溫度50℃，保持8 min，然后以5℃/min升溫到230℃,保持15 min；載氣為N2，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣口溫度220℃，檢測(cè)器溫度230 ℃，分流比 33∶1，進(jìn)樣 1 μL。質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，質(zhì)量范圍20～550 u，離子源溫度230℃，接口溫度230℃。

樣品檢測(cè)：吸取200 μL內(nèi)標(biāo)乙酸正丁酯溶液，置于10 mL的容量瓶中，用每一酵母添加量梯度的酒樣定容，充分混勻，取混合酒樣/內(nèi)標(biāo)溶液1 μL于色譜進(jìn)樣瓶中，氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[12]

用移液器分別吸取正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置于10 mL容量瓶中，每一容量瓶中均加入內(nèi)標(biāo)乙酸正丁酯溶液200 μL，充分混勻，然后用60%vol乙醇溶液定容，取各濃度下混合標(biāo)樣/內(nèi)標(biāo)溶液1 μL于色譜進(jìn)樣瓶中，氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定，各標(biāo)樣溶液濃度結(jié)果見(jiàn)表1。

1.2.3 樣品實(shí)驗(yàn)發(fā)酵

純種YSY16菌株麩曲制備：將培養(yǎng)好的液態(tài)純種YSY16菌株，接種于卡氏罐，30℃恒溫培養(yǎng)5 d，卡氏罐中培養(yǎng)好的YSY16菌株全部接種于蒸汽滅菌的麩曲中培養(yǎng)。采用梯度稀釋法，對(duì)培養(yǎng)好的純種YSY16菌株麩曲檢測(cè)菌株數(shù)量，菌株數(shù)量達(dá)到108為合格標(biāo)準(zhǔn)麩曲。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度 (g/L)

實(shí)驗(yàn)樣品發(fā)酵：取車(chē)間配制好的酒醅，每份稱(chēng)取2000 g，并在每份中添加檢測(cè)合格的純種YSY16菌株麩曲，按照0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的比例，每一梯度平行3次，攪拌均勻后分別裝入2 L發(fā)酵瓶中，密封發(fā)酵瓶，置于生化培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)箱設(shè)置條件：起始溫度18℃，以2℃/d的條件保持升溫9 d，升溫到頂溫36℃，頂溫保持7 d，再以1℃/d的條件保持降溫12 d，使培養(yǎng)箱溫度達(dá)到24℃，發(fā)酵周期為28 d，確保酒醅在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱中發(fā)酵條件和周期與生產(chǎn)車(chē)間保持一致。

蒸餾取酒：將發(fā)酵好的酒醅取出來(lái)，置于不銹鋼蒸餾器中，在蒸餾取酒過(guò)程中注意根據(jù)蒸汽情況添加酒醅，注意冷卻水的溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將1 μL標(biāo)準(zhǔn)品/內(nèi)標(biāo)混合物通過(guò)氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，整理所獲得數(shù)據(jù)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度比內(nèi)標(biāo)乙酸正丁酯的濃度為X（C/Ci）軸，以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積比內(nèi)標(biāo)品峰面積為Y（A/Ai）軸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1中A為正丙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.8652x-0.0029，R2值0.9962；圖1中B為正丁醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其標(biāo)準(zhǔn)方程為y=1.2826x-0.015，R2值0.9989；圖1中C為異丁醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其標(biāo)準(zhǔn)方程為y=1.2422x+0.0069，R2值0.9978；圖1中D為異戊醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其標(biāo)準(zhǔn)方程為y=1.1665x+0.0697，R2值0.9979。4條標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均在兩個(gè)9以上，線性關(guān)系接近1，符合標(biāo)準(zhǔn)曲線要求，可以用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

2.2 實(shí)驗(yàn)蒸餾酒中4種高級(jí)醇的氣相質(zhì)譜檢測(cè)

將實(shí)驗(yàn)室模擬發(fā)酵瓶中的酒樣，通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，實(shí)驗(yàn)室模擬發(fā)酵蒸餾獲得酒樣可以檢測(cè)到這原酒中常檢查的1種樣品，其正丙醇的保留時(shí)間為2.633 min，異丁醇的保留時(shí)間為3.991 min，正丁醇的保留時(shí)間為5.276 min，異戊醇的保留時(shí)間為8.630 min。

2.3 不同酵母添加量對(duì)4種高級(jí)醇產(chǎn)量的影響

2.3.1 不同酵母添加量對(duì)正丙醇產(chǎn)量的影響

將酵母添加量0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的酒醅在生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，獲得陶融型實(shí)驗(yàn)酒樣，經(jīng)氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，酒樣中正丙醇產(chǎn)量結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 高級(jí)醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 氣相質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果

圖3 不同酵母添加量對(duì)正丙醇產(chǎn)量變化的影響

由圖3可知，正丙醇產(chǎn)量在前期隨著酵母添加量的增加明顯減少，可能是減少發(fā)酵前期酒醅中酵母菌的增殖倍數(shù)，增加了對(duì)氮源的消耗量，對(duì)Ehrlich途徑機(jī)制起到了反饋性抑制。當(dāng)酵母添加量達(dá)到1.50%的比例時(shí)，正丙醇產(chǎn)量最低，為0.394 g/L，正丙醇的減少量達(dá)到了76.8%。因此，酵母添加量為1.50%，陶融型酒中的正丙醇含量最低。

2.3.2 不同酵母添加量對(duì)正丁醇產(chǎn)量的影響

將酵母添加量0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的酒醅在生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵至結(jié)束，獲得陶融型實(shí)驗(yàn)酒樣，經(jīng)氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，酒樣中正丁醇產(chǎn)量結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，當(dāng)酵母添加量達(dá)到2.0%時(shí)，正丁醇產(chǎn)量最低。當(dāng)酵母添加量在0.5%～2.0%時(shí)，正丁醇產(chǎn)量明顯減少，當(dāng)酵母添加量在2.50%時(shí)，正丁醇產(chǎn)量開(kāi)始增加。因此，酵母添加量為2.0%，陶融型酒中的正丁醇產(chǎn)量最低。孫金旭等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，添加酵母菌后，正丁醇產(chǎn)量就會(huì)明顯下降，下降比例達(dá)到165%，而本研究發(fā)現(xiàn)，在酵母添加量為0%～2%時(shí)，正丁醇產(chǎn)量緩慢下降，酵母菌添加量超出2%時(shí)，正丁醇產(chǎn)量反而上升。

圖4 不同酵母添加量對(duì)正丁醇產(chǎn)量變化的影響

2.3.3 不同酵母添加量對(duì)異丁醇產(chǎn)量的影響

將酵母添加量0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的酒醅在生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵至結(jié)束，獲得陶融型實(shí)驗(yàn)酒樣，經(jīng)氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，酒樣中異丁醇產(chǎn)量結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同酵母添加量對(duì)異丁醇產(chǎn)量變化的影響

由圖5得知，在酵母添加量為1.0%時(shí)，異丁醇產(chǎn)量最低，比沒(méi)有添加酵母時(shí)的異丁醇產(chǎn)量降低了72.2%。當(dāng)酵母添加量大于1.0%以后，異丁醇產(chǎn)量開(kāi)始顯著增加。因此，酵母添加量為1.0%，仰韶陶融型酒中的異丁醇產(chǎn)量最低。相比朱靜等[14]對(duì)原酒中異丁醇的降解的研究，本研究的優(yōu)點(diǎn)在于添加酵母菌的方法更加適用于生產(chǎn)，并且還能增加酒醅中酵母菌的含量，可增加酒醅的活力，更加有利于提高原酒產(chǎn)量。

2.3.4 不同酵母添加量對(duì)異戊醇產(chǎn)量的影響

將酵母添加量0%、0.5%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%的酒醅在生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵至結(jié)束，獲得陶融型實(shí)驗(yàn)酒樣，經(jīng)氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，酒樣中異戊醇產(chǎn)量結(jié)果見(jiàn)圖6。

式（1）中，被解釋變量inboundit表示i地區(qū)t時(shí)期入境旅游人次的對(duì)數(shù)；policyit是政策虛擬變量，如果樣本屬于處理組（實(shí)施過(guò)境免簽政策地區(qū)）取值為1，相反，如果樣本屬于對(duì)照組（未實(shí)施過(guò)境免簽政策地區(qū)）取值為0；timeit為時(shí)間虛擬變量，政策實(shí)施前取值為0，政策實(shí)施后取值為1；Xit為控制變量；αi和γt分別表示個(gè)體效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)；Vit為隨機(jī)干擾項(xiàng)。PSM-DID方法重點(diǎn)關(guān)注估計(jì)系數(shù)β3，衡量的是過(guò)境免簽政策的凈效應(yīng)，即過(guò)境免簽政策對(duì)入境旅游的促進(jìn)作用。

圖6 不同酵母添加量對(duì)異戊醇產(chǎn)量變化的影響

由圖6可知，當(dāng)酵母添加量為1.50%時(shí)，異戊醇產(chǎn)量為最少，比未添加酵母的異戊醇產(chǎn)量降低0.469 g/L。孫金旭[15]對(duì)醬香型白酒中異戊醇的產(chǎn)量研究中得到酵母添加量為2.0%時(shí)，異戊醇產(chǎn)量最低，這和本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，因?yàn)樘杖谛驮瓭{酒在生產(chǎn)工藝和酒曲的使用方面與醬香型都不同。因此，酵母添加量為1.50%，仰韶陶融型酒中的異戊醇產(chǎn)量最低。

2.4 生產(chǎn)檢驗(yàn)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室模擬發(fā)酵結(jié)果為依據(jù)，當(dāng)酵母添加量為1.50%時(shí)，總高級(jí)醇產(chǎn)量最低為1.133 g/L，所以在生產(chǎn)車(chē)間額外添加1.50%培養(yǎng)成熟的純種YSY16菌株麩曲。通過(guò)窖池發(fā)酵蒸餾取酒，經(jīng)GC-MS檢測(cè)陶融型原漿酒中4種高級(jí)醇的含量，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 生產(chǎn)車(chē)間高級(jí)醇產(chǎn)量

由圖7可知，在仰韶陶融型生產(chǎn)車(chē)間添加1.50%的純種麩曲酵母，正丙醇產(chǎn)量比沒(méi)有添加純種麩曲酵母的降低了49.1%，正丁醇產(chǎn)量比沒(méi)有添加純種麩曲酵母的降低了28.8%，異丁醇產(chǎn)量比沒(méi)有添加純種麩曲酵母的降低了11.4%，異戊醇產(chǎn)量比沒(méi)有添加純種麩曲酵母的降低了16.9%。在未添加酵母時(shí)，生產(chǎn)車(chē)間釀造出的酒樣中4種高級(jí)醇含量均比實(shí)驗(yàn)室含量低，這可能與生產(chǎn)車(chē)間窖池中窖泥的存在有關(guān)。在酵母添加量為1.50%時(shí)，生產(chǎn)車(chē)間釀造出的酒樣中4種高級(jí)醇除了正丙醇含量比實(shí)驗(yàn)室含量低，其余3種高級(jí)醇含量均高于實(shí)驗(yàn)室酒樣含量，因?yàn)檐?chē)間酒醅的水分、大曲用量、谷殼用量、酒醅pH值、酒醅與糧食配比等對(duì)高級(jí)醇的產(chǎn)量都有很大影響，而整個(gè)操作過(guò)程全部是憑借生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行，因此每次都會(huì)有一定的操作誤差，這對(duì)結(jié)果帶來(lái)一定的影響。

3 結(jié)論

通過(guò)額外添加酵母菌，實(shí)驗(yàn)室模擬發(fā)酵陶融型酒樣，在酵母添加量達(dá)到1.50%的比例時(shí)，正丙醇生成量最低，產(chǎn)量降低了76.8%，在酵母添加量達(dá)到2.0%時(shí)，正丁醇生成量最低，產(chǎn)量降低了55.3%，異丁醇在酵母添加量為1.0%時(shí)，生成量最低，產(chǎn)量降低了72.2%，異戊醇在酵母添加量為1.50%時(shí)，產(chǎn)量最低，為0.517 g/L，比不添加酵母時(shí)異戊醇產(chǎn)量降低了47.6%。生產(chǎn)車(chē)間在添加1.50%酵母時(shí)，正丙醇產(chǎn)量比不添加純種麩曲酵母時(shí)降低了49.1%，正丁醇產(chǎn)量比不添加純種麩曲酵母時(shí)降低了28.8%，異丁醇產(chǎn)量比不添加純種麩曲酵母時(shí)降低了11.4%，異戊醇產(chǎn)量比不添加純種麩曲酵母時(shí)降低了16.9%。

近年來(lái)，有關(guān)通過(guò)酵母添加量的方法來(lái)降低原漿酒中高級(jí)醇含量的研究報(bào)道較少。本研究使陶融型原漿酒中高級(jí)醇總產(chǎn)量降低了55.68%，比孫金旭[13]在酵母添加量對(duì)醬香型白酒中雜油醇影響的研究中總高級(jí)醇產(chǎn)量降低了16.03%，比邢曉晰[16]利用纖維素酶在白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用研究總高級(jí)醇產(chǎn)量降低了40.86%，比羅惠波[17]通過(guò)酶制劑對(duì)濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中高級(jí)醇生成的影響研究中總高級(jí)醇產(chǎn)量降低了40.87%。本研究成本低，工藝簡(jiǎn)單，陶融型原漿白酒中高級(jí)醇的生成量降低顯著，研究對(duì)生產(chǎn)陶融型白酒的指導(dǎo)意義重大。

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