岳 軍，屈海峰，胡世洋，徐友海，寧艷春，惠繼星，王繼艷，金 剛

（中國石油吉林石化公司研究院，吉林吉林132021）

自人類進(jìn)入工業(yè)社會以來，資源環(huán)境問題日益突出，尤其是不可再生的化石能源的大量使用，排放大量二氧化碳所導(dǎo)致的溫室效應(yīng)，已經(jīng)成為不可回避的重大問題[1]。能源與資源的可再生化與環(huán)境友好化是未來轉(zhuǎn)型升級的方向。

2017年9月13日,國家發(fā)改委、國家能源局、財政部等十五部委聯(lián)合印發(fā)《關(guān)于擴(kuò)大生物燃料乙醇生產(chǎn)和推廣使用車用乙醇汽油的實施方案》，根據(jù)方案要求，到2020年，我國全國范圍將推廣使用車用乙醇汽油，到2025年，力爭纖維素乙醇實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，該方案的出臺對于纖維素乙醇的推廣有重大的意義。

木質(zhì)纖維素材料是光合作用的產(chǎn)物，產(chǎn)量巨大而且可再生，可以用作生產(chǎn)液體燃料的原料，成為化石能源的潛在替代品，受到了全世界的廣泛關(guān)注[2-3]。目前，以農(nóng)作物秸稈為代表的木質(zhì)纖維素材料，由于沒有合適的應(yīng)用途徑，大多以堆積、焚燒等形式直接處理，不僅資源浪費，而且造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題，引起了公眾的密切關(guān)注[4-5]。以木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇是解決秸稈焚燒以及減少二氧化碳排放的有效途徑。以玉米秸稈為原料制備燃料乙醇為例，與同等體積的汽油相比，二氧化碳排放量要減少70%以上[6]。

木糖渣是玉米芯提取木糖后的廢渣，其纖維素含量可以達(dá)到60%～70%之間，由于大部分半纖維素已經(jīng)被脫除，纖維素的轉(zhuǎn)化率大幅度的提高，可以作為發(fā)酵產(chǎn)乙醇的原料[7-8]。但是與淀粉質(zhì)原料相比，使用木質(zhì)纖維素材料發(fā)酵產(chǎn)乙醇還存在諸多的問題，其中之一便是發(fā)酵醪液中的乙醇濃度較低，蒸餾過程中的能耗大[9]。木糖渣作為玉米芯生物煉制的典型材料，其應(yīng)用模式對于其他農(nóng)作物秸稈而言具有一定的借鑒意義。已有文獻(xiàn)研究了木糖渣發(fā)酵產(chǎn)乙醇的過程，取得了一定的效果，但還存在諸如發(fā)酵周期長、乙醇濃度低的問題；有研究以水解液作為發(fā)酵原料，雖然可縮短發(fā)酵周期，但操作過程較為繁瑣[10-11]。因此仍需對木糖渣發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的過程進(jìn)行進(jìn)一步研究，提高發(fā)酵醪液中的乙醇濃度。

本研究以木糖渣為原料，研究了底物濃度、酶用量對于乙醇濃度的影響，在此基礎(chǔ)上，采用補(bǔ)料發(fā)酵進(jìn)一步提高底物濃度，研究了不同補(bǔ)料次數(shù)、補(bǔ)料量對于乙醇濃度的影響，對于木糖渣生產(chǎn)燃料乙醇的進(jìn)一步推廣具有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

木糖渣：山東龍力生物科技有限公司，自然風(fēng)干后，儲存于自封袋中，平衡水分24 h后備用。

纖維素酶：上海寶曼生物科技有限公司，濾紙酶活162.7 FPU/g，β-葡萄糖苷酶酶活40.9 IU/g。

釀酒活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；實驗過程中所用的酵母粉、蛋白胨為生化試劑，乙醇、濃硫酸等化學(xué)試劑皆為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 同步糖化發(fā)酵

將1.0g干酵母及100mL無菌水分別置于300mL三角瓶中，于30℃、180 r/min下活化2 h?；罨Y(jié)束后，取5 mL酵母活化液接入300 mL裝有已滅菌木糖渣的三角瓶中（三角瓶中除含有木糖渣外，還包括45 mL含有10.0 g/L蛋白胨、5.0 g/L酵母抽提物的水溶液），并按照實驗所需酶用量加入纖維素酶，用錫箔紙封口后，于30℃、180 r/min下進(jìn)行同步糖化發(fā)酵，測定乙醇濃度，并計算纖維素轉(zhuǎn)化率，公式如下。

1.2.2 半同步糖化發(fā)酵

稱取5 g木糖渣于250 mL三角瓶中，加入45 mL去離子水，0.5 g蛋白胨及0.25 g酵母抽提物，121℃滅菌并降至室溫后，向三角瓶中加入纖維素酶。錫箔紙封口后將三角瓶置于50℃振蕩培養(yǎng)箱中，以180 r/min酶解糖化48 h，每隔24 h取樣并進(jìn)行補(bǔ)料，采用高效液相色譜(HPLC)測定水解液中葡萄糖的濃度。48 h后將溫度設(shè)置為30℃，三角瓶溫度降至室溫后，加入酵母活化液5 mL，放置于30℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行補(bǔ)料同步糖化發(fā)酵，期間每隔24 h取樣，并分析樣品中的葡萄糖及乙醇濃度。

1.2.3 分析和測定方法

木糖渣化學(xué)組分的測定：木糖渣中水分、木質(zhì)素、纖維素等組分含量按文獻(xiàn)中所述方法進(jìn)行測定[12]。

酶解液或發(fā)酵液中葡萄糖和乙醇濃度的測定：吸取木糖渣水解液或是發(fā)酵液，以10000 r/min離心5 min后，用去離子水將上清液稀釋到一定倍數(shù)，采用液相色譜進(jìn)行測定。

高效液相色譜分析條件：儀器LC20A(日本島津)，流動相：0.005 mol/L硫酸溶液，色譜柱bio-rad HPX 87H，流速：0.6 mL/min，柱溫：55 ℃，檢測器：RID 10A。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶用量影響

將纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖的過程中，纖維素酶起著關(guān)鍵作用。如何降低酶水解過程中纖維素酶的成本是纖維素乙醇大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)需要解決的問題之一。酶的現(xiàn)場生產(chǎn)以及開發(fā)更高效的酶制劑是有效的解決方案[13-14]，而對于特定底物而言，研究酶用量的影響，在保證較高轉(zhuǎn)化率的前提下，盡量減少纖維素酶的用量也可以在一定程度上降低酶用量。

以木糖渣為底物，發(fā)酵底物濃度為10 g/100 mL，纖維素酶在發(fā)酵初期添加，采用同步糖化發(fā)酵，對比了不同酶用量對乙醇濃度的影響，結(jié)果見圖1。圖1表明,在不同的發(fā)酵時間點，發(fā)酵液中的乙醇濃度隨著酶用量的增加而相應(yīng)增加。酶用量由15 FPU/g底物增加到35 FPU/g底物，發(fā)酵24 h乙醇濃度由8.3 g/L增加到24.4 g/L，發(fā)酵48 h乙醇濃度由19.0 g/L增加到31.0 g/L，發(fā)酵72 h乙醇濃度由22.5 g/L增加到32.0 g/L。當(dāng)酶用量由20 FPU/g底物增加到35 FPU/g底物，發(fā)酵時間分別為24 h與48 h時，發(fā)酵液中的乙醇濃度差異明顯；發(fā)酵時間分別為48 h與72 h時，乙醇濃度的差異不大，表明發(fā)酵48 h時大部分纖維素已經(jīng)被降解為酵母可以利用的發(fā)酵性糖，并被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙醇。因此當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0 g/100 mL時，酶用量達(dá)到20 FPU/g底物以上，發(fā)酵時間以48 h較為適宜。

采用origin8.0對發(fā)酵48 h時，酶用量與乙醇濃度進(jìn)行了擬合，結(jié)果如圖2所示，擬合方程為y=-0.028x2+1.988x-3.929（其中y為乙醇濃度，x為酶用量），擬合模型的p值為0.02，相關(guān)系數(shù)R2為0.955表明該方程擬合良好，可以對結(jié)果進(jìn)行很好的預(yù)測。

圖1 酶用量對乙醇濃度的影響

圖2 發(fā)酵48 h酶用量與乙醇濃度的擬合

2.2 底物濃度的影響

在乙醇蒸餾過程中，乙醇濃度對于蒸餾能量的消耗有顯著性的影響，當(dāng)發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)低于5%時，蒸餾過程中消耗的能量將大大增加，為了降低蒸餾過程中的能耗，發(fā)酵液中的乙醇濃度需要增加到5%以上[15]。由于木質(zhì)纖維素類物質(zhì)密度小，吸水性強(qiáng)，纖維素酶水解效率低，顯然提高底物濃度以增加發(fā)酵液中的乙醇濃度是必然選擇[16]。

以木糖渣為底物，酶用量為20 FPU/g底物，對比了底物濃度分別為5.0 g/100 mL、10.0 g/100 mL、15.0 g/100 mL、20.0 g/100 mL對乙醇濃度的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，在上述底物濃度下，發(fā)酵時間由48 h增加到72 h時，乙醇濃度變化較小，表明在底物濃度不變的情況下，發(fā)酵48 h即可。當(dāng)?shù)孜餄舛扔?.0 g/100 mL增加到20.0 g/100 mL時，各發(fā)酵時間點乙醇濃度呈逐漸增加的趨勢，發(fā)酵96 h時乙醇濃度分別為12.1 g/L、29.0 g/L、38.5 g/L、37.5g/L。底物濃度由5.0g/100mL增加到15.0g/100mL時，乙醇濃度增加較多，而底物濃度由15.0 g/100 mL增加到20.0 g/100 mL時，每個發(fā)酵時間點的乙醇濃度均相差不大。單位底物酶用量相同，底物濃度增加到20.0 g/100 mL情況下，乙醇濃度增加較少，原因可能是在底物濃度為20.0 g/100 mL時，發(fā)酵液的黏度過大，傳質(zhì)效率下降。進(jìn)一步比較了96 h時，4種底物濃度下，纖維素轉(zhuǎn)化率的變化，結(jié)果見表1。由表1可知，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥?0.0 g/100 mL時，轉(zhuǎn)化率已經(jīng)由最高的87.1%下降到了56.3%,表明單位底物酶用量相同時，底物濃度增加后轉(zhuǎn)化率下降。此外還發(fā)現(xiàn)，與酶用量對乙醇濃度影響的結(jié)果相類似，當(dāng)?shù)孜餄舛裙潭ú蛔儠r，發(fā)酵48 h乙醇濃度已經(jīng)接近最高值（圖3），從提高發(fā)酵效率角度來看，發(fā)酵48 h較為適宜。

圖3 底物濃度對乙醇濃度的影響

表1 發(fā)酵96 h底物濃度與纖維素轉(zhuǎn)化率的對比

2.3 補(bǔ)料次數(shù)的影響

纖維素乙醇發(fā)酵過程中，由于一次性加料容易造成底物濃度過高而導(dǎo)致傳質(zhì)效率的下降，在發(fā)酵起始時底物濃度不宜過高。實現(xiàn)纖維素乙醇發(fā)酵的高乙醇濃度，需要在發(fā)酵過程中分批次添加發(fā)酵底物，從而逐步增加底物濃度。

以木糖渣為底物，酶用量為20 FPU/g底物，纖維素酶在發(fā)酵初始時添加，起始底物濃度為15.0 g/100 mL，對比了補(bǔ)料次數(shù)對乙醇濃度的影響，結(jié)果見圖4。補(bǔ)料次數(shù)分別為1～5次，補(bǔ)料間隔時間為24 h，每次補(bǔ)相同質(zhì)量的木糖渣，120 h時所有試驗組中的總底物濃度均達(dá)到30.0 g/100 mL，具體補(bǔ)料情況見表2。從圖4可看出,發(fā)酵時間分別為24 h、48 h、72 h時各試驗組的乙醇濃度相差不大。發(fā)酵120 h時各補(bǔ)料試驗組的乙醇濃度均達(dá)到最大，其中最高的是補(bǔ)料次數(shù)為2次的試驗組，乙醇濃度達(dá)到70.0 g/L。為了進(jìn)一步研究補(bǔ)料次數(shù)對乙醇濃度的影響，對不同發(fā)酵時間下補(bǔ)料次數(shù)對乙醇濃度的影響進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表3。從表3可以看出，發(fā)酵時間從24 h延長到192 h，p值均大于0.05，表明在起始底物濃度一致、酶用量相同、終補(bǔ)料濃度相同的情況下，分別進(jìn)行不同次數(shù)的補(bǔ)料對乙醇濃度并沒有顯著性的影響。

圖4 補(bǔ)料次數(shù)對乙醇濃度的影響

表2 不同補(bǔ)料次數(shù)的補(bǔ)料操作情況

為了進(jìn)一步的對比不同補(bǔ)料次數(shù)對乙醇發(fā)酵的影響，分析了在不同發(fā)酵時間點、補(bǔ)料次數(shù)對轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，發(fā)酵時間分別為48 h、72 h時，隨著補(bǔ)料次數(shù)的增加，轉(zhuǎn)化率也隨之增加，以發(fā)酵72 h為例，轉(zhuǎn)化率最高的是補(bǔ)料次數(shù)為5次的試驗組，其轉(zhuǎn)化率為67.3%，隨著補(bǔ)料次數(shù)的減少，轉(zhuǎn)化率依次為65.2%、58.6%、52.2%、51.2%。

表3 補(bǔ)料次數(shù)對乙醇濃度影響的方差分析

圖5 補(bǔ)料次數(shù)對轉(zhuǎn)化率的影響

進(jìn)行1次補(bǔ)料，24 h其纖維素轉(zhuǎn)化率為45.8%，24 h補(bǔ)料后，48 h轉(zhuǎn)化率降低到37.8%，48 h之后逐漸上升；進(jìn)行2次補(bǔ)料，補(bǔ)料時間分別在24 h、48 h，其相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為38.8%、53.5%，72 h時轉(zhuǎn)化率為52.1%；進(jìn)行3次補(bǔ)料，補(bǔ)料時間分別為24 h、48 h、72 h，其相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為42.2%、56.2%、58.6%，96 h時轉(zhuǎn)化率為56.2%。從所列舉的數(shù)據(jù)可以看出，補(bǔ)料次數(shù)分別為第1次及第2次時補(bǔ)料后的轉(zhuǎn)化率有所下降，其中的原因是，補(bǔ)料后底物的量增加速度過快，而纖維素酶水解纖維素的速度隨著時間的延長而逐漸下降[17]，增加的底物并不能很快的被纖維素酶降解成酵母可利用的葡萄糖。當(dāng)補(bǔ)料次數(shù)為4次與5次時，96 h之前轉(zhuǎn)化率是逐漸增加的，96 h之后呈下降趨勢，所補(bǔ)的底物已不能被完全酶解，若發(fā)酵時間延長至144 h之后，補(bǔ)料次數(shù)對于轉(zhuǎn)化率的影響不顯著。

2.4 補(bǔ)料量的影響

以木糖渣為底物，起始濃度為15.0 g/100 mL，纖維素酶的用量為15 FPU/g底物，24 h后進(jìn)行補(bǔ)料，具體補(bǔ)料的情況見表4，補(bǔ)料后總底物濃度分別為40.0 g/100 mL、50.0 g/100 mL、52.5 g/100 mL，研究了不同補(bǔ)料量對乙醇濃度的影響，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，發(fā)酵時間96 h，3種補(bǔ)料量的乙醇濃度差異不大，96 h之后乙醇濃度有所下降，下降最大的是底物濃度為50.0 g/100 mL、52.5 g/100 mL的試驗組，發(fā)酵168 h時乙醇濃度僅為53.2 g/L、51.5 g/L。

表4 不同補(bǔ)料量的補(bǔ)料操作情況

圖6 補(bǔ)料量對乙醇濃度的影響

值得注意的是3種底物濃度下，發(fā)酵液中的葡萄糖均呈上升趨勢。發(fā)酵168 h時，葡萄糖濃度分別為9.0 g/L、19.4 g/L、20.8 g/L，表明在發(fā)酵后期，酵母活性下降，不能將酶水解產(chǎn)生的葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇。原因可能是補(bǔ)料后，隨著酶水解的進(jìn)行，酚類物質(zhì)逐漸被釋放出來，其濃度不斷增加，抑制了酵母活性[18]。

進(jìn)一步比較了酶用量為20 FPU/g底物，總底物濃度為40.0 g/100 mL的乙醇發(fā)酵情況，酶用量由15 FPU/g底物增加到20 FPU/g底物時，96 h乙醇濃度由64.9 g/L增加到75.8 g/L。發(fā)酵168 h時葡萄糖也有積累，濃度為7.8 g/L（圖6）。

2.5 木糖渣的半同步糖化發(fā)酵

由于纖維素酶酶解木質(zhì)纖維素材料的最適溫度與酵母生長最適溫度的差異性，同步糖化發(fā)酵時，溫度只能為適宜于酵母生長的溫度。在此條件下纖維素酶的水解效率較低，高底物濃度的纖維素乙醇發(fā)酵過程中，會降低纖維素的轉(zhuǎn)化率并延長發(fā)酵時間。半同步糖化發(fā)酵，首先進(jìn)行預(yù)糖化，預(yù)糖化一段時間后，進(jìn)行同步糖化發(fā)酵。此發(fā)酵方式，將分步糖化發(fā)酵與同步糖化發(fā)酵兩種方式的優(yōu)點結(jié)合起來，可在一定程度上避免因發(fā)酵溫度低而造成的纖維素轉(zhuǎn)化率下降的問題，可以提高纖維素的轉(zhuǎn)化率并縮短發(fā)酵的周期[19]。

以木糖渣為底物，酶用量為20 FPU/g底物，起始底物濃度為15.0 g/100 mL，首先于50℃下進(jìn)行預(yù)糖化48 h，后進(jìn)行補(bǔ)料同步糖化發(fā)酵，補(bǔ)料情況見表5。半同步糖化發(fā)酵情況見圖7。圖7表明，預(yù)糖化24 h時，葡萄糖濃度為13.1 g/L，48 h時葡萄糖濃度為14.4 g/L。依照理論值計算，預(yù)糖化24 h時，乙醇濃度僅能達(dá)到6.7 g/L，而相應(yīng)條件下的同步糖化發(fā)酵24 h時的乙醇濃度可以達(dá)到20.0 g/L以上（圖4、圖6數(shù)據(jù)）。預(yù)糖化48 h時接種酵母，于30℃進(jìn)行同步糖化發(fā)酵，96 h時的乙醇濃度為16.9 g/L，而同步糖化發(fā)酵96 h時的乙醇濃度可以達(dá)到50.0 g/L以上（圖4、圖6數(shù)據(jù)），半同步糖化發(fā)酵效果不佳。與同步糖化發(fā)酵相比，采用預(yù)糖化并沒有增加體系中的葡萄糖濃度，具體原因還有待進(jìn)一步的分析。而文獻(xiàn)報道中，采用半同步糖化發(fā)酵可以有效提高纖維素的轉(zhuǎn)化率及乙醇濃度[18-21]，本試驗以木糖渣的研究中并沒有取得與文獻(xiàn)報道相一致的結(jié)果。

表5 半同步糖化發(fā)酵補(bǔ)料操作情況

3 結(jié)論

圖7 半同步糖化發(fā)酵

3.1 纖維素酶用量與底物濃度相同的情況下，發(fā)酵48 h時，乙醇濃度可以達(dá)到較高的水平；酶用量為20 FPU/g底物，底物濃度為15.0 g/100 mL與20.0 g/100 mL，乙醇濃度差異不明顯。

3.2 底物濃度大于10 g/100 mL時，單位底物酶用量保持不變，底物濃度繼續(xù)增加后纖維素轉(zhuǎn)化率下降。

3.3 酶用量為20 FPU/g底物，起始底物濃度為15.0 g/100 mL，通過不同的補(bǔ)料次數(shù)（1～5次），補(bǔ)料到最終底物濃度為30.0 g/100 mL時，在95%置信水平，補(bǔ)料次數(shù)對乙醇濃度沒有顯著性影響。

3.4 酶用量為15 FPU/g底物，起始底物濃度為15.0 g/100 mL，通過增加補(bǔ)料量到40.0 g/100 mL、50.0 g/100 mL、52.5 g/100 mL，乙醇濃度并不能隨著底物濃度的增加而增加。不同補(bǔ)料量下，在96 h時乙醇濃度達(dá)到最大，96 h后發(fā)酵液中的葡萄糖濃度不斷增加。酶用量為20 FPU/g底物時，補(bǔ)料到最終底物濃度為40.0 g/100 mL，96 h時乙醇濃度達(dá)到75.8 g/L。

3.5 本研究的實驗條件下，與同步糖化發(fā)酵相比，半同步糖化發(fā)酵乙醇濃度明顯低于同步糖化發(fā)酵，半同步糖化發(fā)酵不能提高乙醇濃度及纖維素轉(zhuǎn)化率，其中原因還有待進(jìn)一步研究。

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