丁 燕 ，Roland Harrison，Richard Hider，王詠梅 ，郭亞蕓 ，王 哲 ，史紅梅 ，韓曉梅

（1.山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南250100； 2.新西蘭林肯大學(xué)葡萄酒食品及分子生物學(xué)系，新西蘭坎特伯雷7647；3.山東省葡萄栽培與精深加工工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南250100）

酚類物質(zhì)是葡萄中重要的次生代謝產(chǎn)物，作為一大類復(fù)雜的具有抗氧化性的物質(zhì)，主要參與形成葡萄酒的味道、骨架、結(jié)構(gòu)和顏色等，對(duì)紅葡萄酒的特征和質(zhì)量尤其重要[1]。葡萄發(fā)酵結(jié)束后的原酒，為了提高其飲用品質(zhì)，需經(jīng)過(guò)一定的貯藏期進(jìn)行一系列縮合、聚合作用及氧化還原反應(yīng)[2-3]。瓶貯是葡萄酒儲(chǔ)藏的主要方式之一，在瓶貯期間受氧接觸等因素的影響，葡萄酒中的多酚等物質(zhì)會(huì)發(fā)生一系列比較復(fù)雜的反應(yīng)，顏色更加趨于穩(wěn)定，而酒的風(fēng)味和香氣物質(zhì)的復(fù)雜性和細(xì)膩性也會(huì)有所增加，最終擁有比原酒更好的感官質(zhì)量[4-5]。

研究人員曾采用不同的儲(chǔ)藏方法和不同的參數(shù)指標(biāo)研究分析其對(duì)酒中酚類物質(zhì)變化的影響。Porgal?等[6]將啟瓶葡萄酒在4℃下進(jìn)行避光保存。Granato等[7]將葡萄酒分成不同等份后進(jìn)行液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆梅治觥irsanov等[8]將葡萄酒進(jìn)行-20℃冷凍保存，然后在22℃下解凍分析。Wirth等[9]采用不同透氧率（OTR）合成塞的桃紅酒在23℃下瓶貯10個(gè)月后進(jìn)行分析。Marquez等[10]將紅葡萄酒進(jìn)行頂空充氮?dú)?，?0℃避光保存。Lago-Vanzela等[11]研究了不同溫度下瓶貯4個(gè)月后的紅葡萄酒中總酚的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著儲(chǔ)藏溫度升高，總酚含量呈下降趨勢(shì)。Marquez等[10]將葡萄酒于20℃下儲(chǔ)藏12個(gè)月，研究這期間葡萄酒中單寧含量的變化，發(fā)現(xiàn)單寧含量呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)。Tarola等[12]研究了未啟瓶葡萄酒在不同貯藏條件下以及啟瓶后白藜蘆醇和黃烷醇單體的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明，4℃下避光保存1周的葡萄酒中反式和順式白藜蘆醇的含量均保持穩(wěn)定，而開瓶后兒茶素含量有所升高，而表兒茶素含量則呈下降趨勢(shì)。而Proestos等[13]的研究則發(fā)現(xiàn)，啟瓶葡萄酒在5℃下保存4個(gè)月后，兒茶素和表兒茶素分別下降了65%和99%，其認(rèn)為是由于這些物質(zhì)在開瓶后發(fā)生了氧化和聚合反應(yīng)而引起的。Dallas等[14]研究了10～40℃儲(chǔ)藏溫度區(qū)間葡萄酒中花色苷等物質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)隨著儲(chǔ)藏溫度的升高，花色苷含量有所降低，而聚合色素含量則呈上升趨勢(shì)。而Marquez等[10]和Wirth等[9]研究發(fā)現(xiàn)20℃左右溫度下避光保存的葡萄酒中花色苷呈下降趨勢(shì)，聚合色素則相反，而桃紅葡萄酒中吡喃花色苷的苯基衍生物尤其是3,4-二羥基-苯基-吡喃花色苷的濃度呈上升趨勢(shì)。

關(guān)于葡萄酒瓶?jī)?chǔ)的相關(guān)研究還有很多，但關(guān)于啟瓶后儲(chǔ)藏對(duì)其品質(zhì)影響的研究報(bào)道相對(duì)較少，基于此，本文通過(guò)探究黑比諾葡萄酒啟瓶后在不同的貯藏條件下總酚、單寧、花色苷以及顏色等參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化，以期對(duì)葡萄酒啟瓶后品質(zhì)變化的研究以及啟瓶后儲(chǔ)藏方法的改進(jìn)有所助益。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：選取2014年份Mt.Difficulty黑比諾（新西蘭中奧塔哥產(chǎn)區(qū)）-MD和2015年份Saint Clair黑比諾（新西蘭馬爾堡產(chǎn)區(qū)）-SC作為酒樣。

試劑及耗材：硫酸銨、甲基纖維素、(-)-表兒茶素、沒(méi)食子酸等，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；鹽酸（32%）、磷酸（85%）、乙醛等，購(gòu)自Ajax Fine Chemicals公司；氫氧化鈉、焦亞硫酸鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、無(wú)水碳酸鈉等均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為純凈水和去離子水。

儀器設(shè)備：紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-1800，日本島津公司；Suntex SP-701型pH計(jì)；Biofuge 15臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Heraeus公司；Multifuge X1R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；磁力攪拌器；2 mm石英比色皿、1.5 mL和2.5 mL一次性紫外級(jí)比色皿，德國(guó)Brand公司；Grant TX150-ST12恒溫水浴槽，英國(guó)Grant公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理（表1）

表1 葡萄酒啟瓶后不同的儲(chǔ)藏處理方式

酒樣啟瓶后，將大約10 mL葡萄酒等分試樣盡快轉(zhuǎn)移到15 mL具塞離心管中，留5 mL的頂部空間，每個(gè)酒樣等分72個(gè)離心管，然后按照表1中的處理方法進(jìn)行處理。所有試管用鋁箔包裹進(jìn)行避光處理，然后需要進(jìn)行頂空充氮處理的酒樣盡快充氮?dú)獗４?，分別于啟瓶后1 d、8 d、20 d、30 d、43 d、134 d取樣檢測(cè)。注意：BN、BY、CN、DN號(hào)處理需在啟瓶后1 d、8 d、20 d、30 d、43 d、134 d前夜就各取出2瓶酒樣室溫下放置10 h待測(cè)。先測(cè)定所有酒樣的顏色指標(biāo)，再檢測(cè)總酚及單寧含量，1 d內(nèi)完成所有指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2 分析及檢測(cè)方法

總酚測(cè)定：采用Wrolstad等[15]的福林-肖卡法，測(cè)定前酒樣用去離子水稀釋5倍。

單寧測(cè)定：采用Sarneckis等[16]的方法。

色度、色調(diào)、總單體花色苷、離子花色苷、聚合色素等指標(biāo)的測(cè)定：采用Somers等[17]的方法，酒樣pH值調(diào)至3.5。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel和Genstat統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，用Fisher最小顯著差異法（Fisher’s test for least significant difference，LSD）比較各處理間的差異顯著性（α=0.05）。數(shù)據(jù)結(jié)果在進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)前先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。具體來(lái)說(shuō)，將所有處理第1天所測(cè)得不同指標(biāo)的數(shù)據(jù)平均值均設(shè)置為100，其余各處理的不同指標(biāo)的數(shù)據(jù)則按照其個(gè)體值與第1天所得的數(shù)據(jù)平均值（100）的比率來(lái)計(jì)算出其平均相對(duì)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同儲(chǔ)藏處理對(duì)酚類物質(zhì)等指標(biāo)的總影響趨勢(shì)（表2）

從表2可以看出，不同的儲(chǔ)藏時(shí)間和儲(chǔ)藏方法對(duì)各指標(biāo)的影響程度不同。啟瓶后134 d時(shí)，總酚、總紅色素、離子花色苷和總單體花色苷比最初時(shí)有顯著下降，其中總單體花色苷下降幅度最大，比第1天時(shí)下降40%，其次是離子化花色苷、總紅色素和總酚含量。而與此相反，單寧、色度、色調(diào)、紅色著色度、聚合色素以及“化學(xué)年齡”則顯著提高，其中“化學(xué)年齡”上升幅度最大，幾乎為第1天時(shí)的2倍，而色調(diào)、紅色著色度以及聚合色素的上升幅度基本相同，大約提高了30%。單寧和色度上升最少，但與第1天相比依然差異顯著。

表2 黑比諾葡萄酒啟瓶后不同儲(chǔ)藏處理的各指標(biāo)平均相對(duì)值

從表2還可看出，啟瓶后室溫儲(chǔ)藏對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的影響程度最顯著，其中化學(xué)年齡和總單體花色苷變化幅度最大，而室溫儲(chǔ)藏頂空充氮?dú)夂筒怀涞獨(dú)馓幚碇g除了后者比前者的色調(diào)略高之外，其余各項(xiàng)指標(biāo)之間差異不顯著。4℃冷藏?zé)o論頂空充氮?dú)饣虿怀涞獨(dú)?，與最初時(shí)相比，除色調(diào)之外，其余各指標(biāo)之間無(wú)顯著差異。啟瓶后-20℃冷凍處理的色度和聚合色素指標(biāo)下降顯著，其余指標(biāo)與最初時(shí)相比無(wú)顯著差異。-80℃冷凍處理的各項(xiàng)指標(biāo)與最初時(shí)相比均無(wú)顯著差異。

2.2 不同儲(chǔ)藏處理對(duì)葡萄酒中總酚的影響（表3）

表3 黑比諾葡萄酒啟瓶后不同儲(chǔ)藏處理的總酚平均相對(duì)值

由表3可知，啟瓶后43 d之內(nèi)，總酚浮動(dòng)很小，而從43 d到134 d則呈現(xiàn)較大的變化幅度。此外，從表2可看出，43 d時(shí)所有不同儲(chǔ)藏方式處理的總酚含量平均相對(duì)值約為啟瓶初始時(shí)的97.8%，而到了134 d，則下降為83.2%，這與Lago-Vanzela等[11]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

從表3中還可看出，除了冷藏儲(chǔ)藏處理，其余處理最后1 d的總酚均與初始時(shí)差異顯著。相比之下，其余4個(gè)處理AN、AY、CN、DN的總酚下降幅度較大，其中DN處理下降最大。實(shí)驗(yàn)中觀察到經(jīng)過(guò)冷凍儲(chǔ)藏的酒樣出現(xiàn)了很多沉淀，這可能是其總酚明顯下降的主要原因，而室溫儲(chǔ)藏的酒樣則可能是由于酚類物質(zhì)參與色素物質(zhì)的形成以及啟瓶后葡萄酒中溶解氧較多，使得一些酚類物質(zhì)氧化，因此在利用F-C法測(cè)定總酚時(shí)，由于酒的總還原能力下降而最終導(dǎo)致檢測(cè)值降低。

2.3 不同儲(chǔ)藏處理對(duì)葡萄酒中單寧的影響（表4）

表4黑比諾葡萄酒啟瓶后不同儲(chǔ)藏處理的單寧平均相對(duì)值

由表4可知，BN和BY處理（4℃冷藏）的總單寧比較穩(wěn)定，134 d時(shí)分別為初始時(shí)的95%和98%。CN和DN處理的單寧則比BN和BY處理的有所下降，但差異不顯著。AN和AY處理（室溫儲(chǔ)藏）的總單寧上升相當(dāng)明顯，分別為初始時(shí)的151%和154%。Marquez等[10]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酒在20℃條件下避光保存6個(gè)月內(nèi)單寧含量逐漸升高；Monagas等[18]發(fā)現(xiàn)，即便將葡萄酒儲(chǔ)藏在略低的溫度下（13℃）保存28個(gè)月總單寧也略有增加，這可能是由于酒中黃烷醇單體發(fā)生聚合反應(yīng)生成了較多的單寧物質(zhì)，提高了葡萄酒的澀感[19]。

2.4 不同儲(chǔ)藏處理對(duì)葡萄酒中總單體花色苷的影響（表5）

表5 黑比諾葡萄酒啟瓶后不同儲(chǔ)藏處理的單體花色苷平均相對(duì)值

由表2可知，CN和DN 2個(gè)冷凍儲(chǔ)藏處理的總花色苷含量保持最好，整個(gè)儲(chǔ)藏時(shí)期總單體花色苷平均相對(duì)值均為100%左右，比其他所有處理都更接近初始時(shí)的狀態(tài)。而從表5可以看出，BN和BY處理在43 d內(nèi)變化不顯著，而AN和AY在20 d內(nèi)變化還不是很大，但之后開始大幅下降，最終降至初始值的8%左右，降幅最大，這一變化趨勢(shì)與Dallas等[14]的研究結(jié)果相類似，其研究發(fā)現(xiàn)，在10℃條件下儲(chǔ)藏6個(gè)月的酒樣中花色苷含量要遠(yuǎn)高于40℃儲(chǔ)藏的酒樣，后者最后花色苷含量為4 mg/L。此外，最后1天（第134天）的檢測(cè)結(jié)果顯示，只有CN處理與初始值差異不顯著，其余各處理均差有顯著降低。

2.5 不同儲(chǔ)藏處理對(duì)葡萄酒中聚合色素的影響（表6、圖1）

表6黑比諾葡萄酒啟瓶后不同儲(chǔ)藏處理的聚合色素平均相對(duì)值

從表6可知，AN和AY 2個(gè)室溫儲(chǔ)藏處理的聚合色素在20 d內(nèi)總體變化不顯著，但之后開始大幅上升，最終到第134天時(shí)分別比初始時(shí)升高了75%和79%。而BN和BY 2個(gè)冷藏處理的聚合色素在43 d內(nèi)雖有小幅浮動(dòng)，但變化不顯著。CN和DN 2個(gè)冷凍處理的聚合色素總體呈下降趨勢(shì)，其中CN下降更為明顯一些，而第134天的檢測(cè)結(jié)果顯示，最終只有DN處理與初始值差異不顯著。

圖1 葡萄酒啟瓶后儲(chǔ)藏期間總單體花色苷與聚合色素之間的相關(guān)性

由圖1可知，聚合色素與總花色苷之間具有較好的線性相關(guān)（R2=0.89），且呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)?？偦ㄉ盏南陆抵饕怯捎谠趦?chǔ)藏過(guò)程中，一些單體花色苷轉(zhuǎn)化為了聚合物形式[10，14]。從表5和表6可以看出，啟瓶后室溫儲(chǔ)藏處理的酒樣中聚合色素上升和總單體花色苷下降幅度均最大，這與Dallas等[14]的結(jié)果一致，后者發(fā)現(xiàn)在10～40℃儲(chǔ)藏溫度區(qū)間，溫度升高會(huì)促進(jìn)聚合色素的形成。同樣，Marquez等[10]將紅酒于20℃下儲(chǔ)藏1年，每隔3個(gè)月檢測(cè)1次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約90%的聚合色素都是從單體色素轉(zhuǎn)化而來(lái)的。在該實(shí)驗(yàn)中，室溫儲(chǔ)藏處理比其他處理的溫度更高，更能促進(jìn)氧化和聚合進(jìn)程[2]。而且，由表2、表4和表6看出，室溫處理的總單寧和聚合色素均顯著高于其余處理，而有研究人員發(fā)現(xiàn)，葡萄酒中聚合色素濃度與單寧有密切正相關(guān)關(guān)系[20-21]。

2.6 不同儲(chǔ)藏處理對(duì)葡萄酒色度和色調(diào)的影響（圖2、圖3）

圖2 黑比諾葡萄酒啟瓶后不同儲(chǔ)藏處理的色調(diào)平均相對(duì)值

為了去除SO2的影響，測(cè)定色度色調(diào)時(shí)，在酒樣中加入了一定量的乙醛進(jìn)行處理。從圖2可看出，所有處理的色調(diào)均有不同程度的提高。其中室溫處理的上升幅度最大，其次是4℃冷藏處理，2個(gè)冷凍處理最后1天的色調(diào)與初始時(shí)最接近，整個(gè)儲(chǔ)藏期間色調(diào)保持穩(wěn)定。2個(gè)室溫處理AN和AY在8 d時(shí)，色調(diào)就分別顯著增長(zhǎng)到初始時(shí)的110%和106%，這說(shuō)明啟瓶后室溫存放的酒樣在不到1周的時(shí)間內(nèi)顏色外觀會(huì)發(fā)生明顯變化。

總體來(lái)看，2個(gè)冷藏處理和-80℃冷凍處理在整個(gè)儲(chǔ)藏期間色度保持最穩(wěn)定，其余處理均變化顯著。從圖3可以看出，室溫處理的酒樣色度有顯著增加，這可能是由于儲(chǔ)藏過(guò)程中新色素物質(zhì)形成而引起的色度上升超過(guò)了單體花色苷下降所致色度降低的力度。而與此相反，冷凍處理在最后1天時(shí)的色度顯著下降，這可能與實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的這幾個(gè)處理的離心管管底有大量沉淀有關(guān)。此外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Saint Clair酒樣中的單體花色苷含量要高于Mt.Difficulty酒樣，而Mt.Difficulty酒樣中的總酚和單寧含量則高于Saint Clair，這意味著后者會(huì)因?yàn)檫@些物質(zhì)與花色苷發(fā)生反應(yīng)從而更有利于保持顏色穩(wěn)定。

圖3 黑比諾葡萄酒啟瓶后不同儲(chǔ)藏處理的色度平均相對(duì)值

3 結(jié)論

總體來(lái)看，與花色苷、聚合色素、色度、色調(diào)等顏色指標(biāo)相比，儲(chǔ)藏期間總酚和單寧受溫度升高的影響相對(duì)較小。相比之下，花色苷相關(guān)指標(biāo)在不同儲(chǔ)藏條件下隨儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)而變化更為顯著。實(shí)驗(yàn)表明，啟瓶后-80℃冷凍儲(chǔ)藏是維持葡萄色澤穩(wěn)定的最佳保存方法，其各項(xiàng)顏色相關(guān)指標(biāo)的變化相對(duì)最小，而且經(jīng)過(guò)整個(gè)儲(chǔ)藏期后形成的沉淀也相對(duì)較少；其次是4℃冷藏處理BN和BY。此外，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，2個(gè)葡萄酒樣在整個(gè)儲(chǔ)藏期間總酚變化趨勢(shì)有明顯差異，對(duì)此需要進(jìn)一步研究其原因以及儲(chǔ)藏期間沉淀形成與各項(xiàng)指標(biāo)變化之間的關(guān)系。

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