徐占成，徐姿靜，劉孟華，唐清蘭

(四川劍南春集團(tuán)有限責(zé)任公司，四川綿竹618200)

曲為“酒之骨”，大曲作為我國傳統(tǒng)大曲酒釀造的糖化、發(fā)酵、生香劑，是我國傳統(tǒng)釀造的特征與精華之所在[1]。劍南春作為中國濃香型白酒的典型代表，其生產(chǎn)用曲采用自然接種、開放式發(fā)酵生產(chǎn)，導(dǎo)致大曲中微生物種類繁多，群系復(fù)雜，采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法研究，將會遺漏很多微生物種類，其中甚至可能有關(guān)鍵性功能微生物[2-3]。

宏基因組學(xué)作為一種研究環(huán)境樣品中的微生物總基因組信息的新的微生物研究方法，能通過微生物總基因組信息來反映群落的生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系[4]。該技術(shù)已在許多領(lǐng)域應(yīng)用，在“腸道微生物”[5]“土壤微生物”[6]和“海洋微生物”[7]方向上取得了顯著成就。為認(rèn)識環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)及篩選新基因提供了一條新的方法和思路。

前期本課題組利用宏基因組學(xué)的16S rDNA V4區(qū)高通量測序?qū)δ洗捍笄?xì)菌多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。為了更加深入的探索大曲糖化生香機(jī)理，本研究以劍南春大曲曲藥為研究對象，通過大曲總DNA的提取、PCR擴(kuò)增及構(gòu)建ITS基因文庫，對劍南春大曲真菌群落組成進(jìn)行了全面研究，為進(jìn)一步解析劍南春大曲的功能微生物、篩選優(yōu)良釀造微生物提供堅實的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

劍南春集團(tuán)有限公司的中溫大曲曲藥（由劍南春集團(tuán)公司提供），MO BIO強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒(MO BIO Laboratories,Carlsbad,CA,USA)，其他分子實驗耗材（由上海生工提供）。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取

采用MO BIO強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒(MO BIO Laboratories,Carlsbad,CA,USA)對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至10 ng/μL，保存在-40℃冰箱中以備后續(xù)實驗使用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物和高效高保真的酶(TaKaRa,Dalian)進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

引物對應(yīng)區(qū)域[8]：

ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')；

gITS7F(5'-GTGARTCATCGARTCTTTG-3')。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)的組成：

10 × PCR buffer 2.5 μL,MgCl2(25 mM)6 μL,10 mM dNTP mix 1 μL,雙向引物(10 μM)2 μL,Taq DNA聚合酶（TaKaRa,Dalian）0.5 U，無菌去離子水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸45 s，34個循環(huán)；72℃延伸10 min。每個樣品做2個PCR擴(kuò)增平行樣，最后根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化和定量

PCR產(chǎn)物使用1%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶使用生工公司提供的膠回收試劑盒(Sangon Biotech,China，Cat#SK8132)回收產(chǎn)物，并用Nanodrop進(jìn)行濃度和質(zhì)量的測定。

1.2.4 文庫構(gòu)建和上機(jī)測序

使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和qPCR定量，文庫合格后，使用v2測序試劑盒(2×250 bp)和Miseq測序儀進(jìn)行上機(jī)測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 Alpha多樣性分析

Alpha Diversity用于分析樣品內(nèi)(Within-community)的微生物群落多樣性，通過單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映樣品內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性，包括用稀釋曲線和一系列統(tǒng)計學(xué)分析指數(shù)來評估各樣品中微生物群落的物種豐富度和多樣性。

1.3.2 Beta多樣性分析

Beta多樣性指沿環(huán)境梯度不同生境群落之間物種組成的相異性或物種沿環(huán)境梯度的更替速率，也被稱為生境間的多樣性。

2 結(jié)果和分析

2.1 Alpha多樣性指數(shù)表（表1）

表1 Alpha多樣性指數(shù)(測序深度5786條序列/樣品)

從表1可以看出：3個大曲樣品的Chao1豐富度指數(shù)在37～43范圍內(nèi)變化；Shannon指數(shù)（Index）在3.039～1.889范圍內(nèi)變化；Simpson指數(shù)，其值的變化范圍介于0.567～0.795間。其中，最大值均出現(xiàn)在2號大曲，最小值由1號大曲檢測取得。三大指數(shù)檢測表明在大曲真菌多樣性方面：2號大曲＞3號大曲＞1號大曲。

2.2 群落組成分析

2.2.1 門水平大曲樣品群落組成圖

基于微生物ITS基因，對檢測樣品的有效序列進(jìn)行聚類，以97%的序列相似性將序列在門水平上聚類成為OTU，其結(jié)果見圖1。圖1表明，在3類大曲中，Ascomycota、Zygomycota、Basidiomycota 3類微生物占絕對優(yōu)勢，相對豐度總和均超過90%。其中，1號大曲中，3類微生物相對豐度總和最高，達(dá)到95.65%；而在2號大曲中，3類微生物相對豐度總和最低，為90.88%。由此可見，基于ITS基因的門水平分析結(jié)果，上述3類微生物是劍南春大曲中的優(yōu)勢微生物。

圖1 大曲樣品群落組成圖（門水平）

在所研究樣品中，Ascomycota的相對豐度于30.07%～60.18%的范圍內(nèi)變化。其中，最大值在1號大曲中獲得；最小值在2號大曲中獲得。利用方差分析（ANOVA）對3個不同大曲Ascomycota相對豐度的差異顯著性進(jìn)行檢驗，結(jié)果表明，不同大曲中該類微生物的相對豐度差異并不顯著（p＞0.05）。

從Zygomycota相對豐度值分析，其變化范圍介于28.22%～60.44%之間。其中，在2號大曲中，該類微生物的相對豐度最高，而在1號大曲中最低。而Basidiomycota相對豐度值分析發(fā)現(xiàn)，3個大曲相對豐度值差距不大（＜0.2%）。

對3類優(yōu)勢微生物的總相對豐度進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同大曲間并不存在顯著差異（p＞0.05）。由此可見，基于ITS基因的群落分析表明，劍南春大曲的優(yōu)勢微生物，其相對豐度并無顯著差別。

2.2.2 科水平大曲樣品群落組成圖

利用數(shù)據(jù)庫聚類，在科水平上對不同大曲中微生物的種類進(jìn)行分析，其結(jié)果見圖2。

圖2 大曲樣品群落組成圖（科水平）

從科的水平分析結(jié)果表明，在3類大曲中，Mucoraceae、Saccharomycopsidaceae、Trichocomaceae及Thermoascaceae 4類微生物占均對優(yōu)勢，相對豐度總和均超過85%。其中，1號大曲4類微生物相對豐度總和最高，達(dá)到93.69%；而在2號大曲中，3類微生物相對豐度總和最低，為86.65%。由此可見，基于ITS基因的科水平分析結(jié)果，上述4類微生物是劍南春大曲中的優(yōu)勢微生物。

從各科分析來看：2號大曲，在Mucoraceae的相對豐度值最高達(dá)到60.44%，1號和3號分別為28.22%、32.92%；1號大曲在Saccharomycopsidaceae有最大相對豐度值，為61.15%，2號大曲有最小值16.44%；而在Trichocomaceae及Thermoascaceae分布上3號大曲占據(jù)優(yōu)勢。

對4類優(yōu)勢微生物的總相對豐度進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同大曲間并不存在顯著差異（p＞0.05）。由此可見，基于ITS基因的群落科水平分析表明，劍南春大曲的優(yōu)勢微生物，其相對豐度并無顯著差別。

2.2.3 屬水平大曲樣品群落組成圖

利用數(shù)據(jù)庫聚類，在屬水平對不同大曲中微生物的種類進(jìn)行分析，其結(jié)果見圖3。

圖3 大曲樣品群落組成圖（屬水平）

根據(jù)各屬的相對豐度值，選擇數(shù)值最高的前10類微生物進(jìn)行展示，分別為：Rhizopus、Saccharomycopsis、Aspergillus、Thermoascus、Saccharomyces、Wickerhamomyces、Thermomyces、Amylomyces、Talaromyces、Monascus。

在所有樣品中，Rhizopus的相對豐度值介于26.51%～57.17%之間。其中，最小值在1號大曲獲得；最大值在2號大曲獲得。方差分析（ANOVA）表明，不同大曲間的Rhizopus相對豐度并無顯著差異（p＞0.05）。

Saccharomycopsis的相對豐度在16.44%～61.15%范圍內(nèi)變化。其中，最小值在2號大曲獲得；最大值則在1號大曲獲得。根據(jù)方差分析（ANOVA），結(jié)果表明不同大曲間Saccharomycopsis的相對豐度并無顯著差異（p＞0.05）。

Aspergillus的相對豐度在1.19%～6.22%范圍內(nèi)變化。其中，最小值在1號大曲獲得；最大值則在2號大曲獲得。根據(jù)方差分析（ANOVA），結(jié)果表明不同大曲間Aspergillu的相對豐度并無顯著差異（p＞0.05）。

Thermoascus在檢測大曲樣品中的相對豐度值介于1.711%～5.081%之間。其中，最小值由1號大曲獲得；最大值由3號大曲獲得。經(jīng)方差分析（ANOVA），結(jié)果表明，大曲間的Thermoascus相對豐度并無顯著差異（p＞0.05）。

由此可見，基于ITS基因的群落屬水平分析表明，劍南春大曲的優(yōu)勢真菌群落多樣性分布在Rhizopus、Saccharomycopsis、Aspergillus、Thermoascus、Saccharomyces、Wickerhamomyces、Thermomyces、Amylomyces、Talaromyces、Monascus。這與前期采用PCR-DGGE技術(shù)研究結(jié)果相符[3]。

3 結(jié)論

劍南春大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究結(jié)果表明，劍南春大曲的優(yōu)勢真菌多樣性分布，從門水平說集中在Ascomycota、Zygomycota、Basidiomycota，相對豐度總和超過90%；從科水平說集中在Mucoraceae、Saccharomycopsidaceae、Trichocomaceae及Thermoascaceae，4類微生物相對豐度總和超過80%；從屬水平說主要分布在Rhizopus、Saccharomycopsis、Aspergillus、Thermoascus、Saccharomyces、Wickerhamomyces、Thermomyces、Amylomyces、Talaromyces、Monascus。

霉菌、酵母是白酒生產(chǎn)不可或缺的優(yōu)良菌種，霉菌能產(chǎn)生豐富的葡萄糖淀粉酶，因而可以將原料中的淀粉直接降解為酵母菌可利用的還原糖，進(jìn)而刺激酵母菌的生長，同時促進(jìn)原料中的碳源向發(fā)酵終端產(chǎn)物酒精的代謝。胡承等[9]對濃香型大曲制曲過程中微生物的變化規(guī)律進(jìn)行了研究，其結(jié)果表明，出房大曲中霉菌主要是根霉和曲霉。高亦豹[10]通過對不同工藝大曲酵母26S rRNA區(qū)基因DGGE圖譜分析發(fā)現(xiàn)，扣囊復(fù)膜孢酵母、異常威克漢姆酵母普遍存在于大曲中。本研究利用高通量測序法分析優(yōu)勢菌種與他們的結(jié)果相符，而又更為全面，是對劍南春濃香型大曲真菌群落較為客觀真實的解析。

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