陳興強，梁文妹，夏白娟，李一欣，李容瑢，尹 丹，李 杰

(貴州醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,貴州貴陽550025）

中國是人口大國，經(jīng)濟的快速增長帶動了酒類產(chǎn)品消耗量的上升，也使飲酒問題日益突出。全世界每年因不當飲用酒導(dǎo)致330萬例死亡，占所有死亡數(shù)的5.9%[1]。不當飲用酒被WHO列入全球過早死亡和致殘的主要危險因素之一，也是導(dǎo)致多種疾病和損傷病癥的重要因素之一[2]。但也有報道，適量飲酒可降低心臟病的發(fā)作、動脈粥樣硬化和某些類型卒中以及絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松的危險[3-4]。目前我國飲酒者已超過5億人，人均酒精飲料消費呈每年遞增13%，如何健康飲酒已是當務(wù)之急。

多巴胺-β-羥化酶（Dopamine beta Hydroxylase，DβH）位于腎上腺髓質(zhì)細胞的嗜鉻顆粒中，可以將多巴胺（Dopamine，DA）轉(zhuǎn)化成去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE），是兒茶酚胺（Catecholamine，CA）合成過程中的關(guān)鍵酶。NE在心血管功能調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛和情感調(diào)節(jié)中起到重要作用，DA可以調(diào)控心血管功能和影響精神活動[5]。酒精作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制劑，飲酒后欣快、興奮表現(xiàn)與DβH水平有關(guān)[6]。位于外周神經(jīng)系統(tǒng)的去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白(Norepinephrine transporter，NET)分布于交感神經(jīng)節(jié)后纖維支配的組織，如心臟、腎上腺髓質(zhì)、肝臟，是交感神經(jīng)神經(jīng)遞質(zhì)信號傳導(dǎo)的重要環(huán)節(jié)，對維持心血管系統(tǒng)正常功能發(fā)揮著重要作用[7]。不同的心血管疾病均可伴有交感神經(jīng)系統(tǒng)異常，而NET的功能變化可能在上述疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[8-9]。酒類產(chǎn)品作為日常生活中的一種飲品，如何飲酒才能降低或消除其對健康的危害，已經(jīng)成為眾多學(xué)者關(guān)注的焦點，但關(guān)于飲酒對大鼠腎上腺髓質(zhì)細胞DβH、NET的影響鮮見報道。本實驗?zāi)M正常人飲酒習(xí)慣，采用54%vol董香型白酒制作大鼠飲酒模型，采用免疫組織化學(xué)SABC法、蛋白免疫印跡法檢測飲酒后不同劑量和不同時間下大鼠腎上腺髓質(zhì)細胞中DβH、NET表達水平的變化，旨在為科學(xué)健康飲酒提供一定的基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立

將健康成年大鼠120只（180～220 g/只）適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組（normal control group，NCG）30只和實驗組（experiment group，EG）90只。實驗組隨機分為4周組（4W）、8周組（8W）、12周組（12W）、16周組（16W）、20周組（20W）各18只大鼠，每組又分為3個劑量組，即低劑量組(Low dose group，LG，0.8 mL/kg·d)、中劑量組(Middle dose group，MG，1.6 mL/kg·d)及高劑量組(High dose group，HG，2.4 mL/kg·d)。各實驗組大鼠分別于每日上午11點及下午5點給予相應(yīng)劑量的54%vol董香型白酒灌胃1次，直至取材前1天，正常對照組正常喂養(yǎng)。

1.2 取材及標本處理

分別于各取材點麻醉大鼠后處死，取腎上腺組織，部分使用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制作4 μm連續(xù)切片（3張/只，每張間隔56 μm），進行免疫組織化學(xué)染色；部分腎上腺組織入液氮20 min后，-80℃保存，以備用作蛋白質(zhì)免疫印跡測定。

1.3 免疫組織化學(xué)SABC法

切片常規(guī)化蠟下行入水，常溫10%甲醇-H2O2處理10 min，羊血清（1∶10）常溫下封閉30 min，兔抗NET多克隆抗體（1∶100），兔抗DβH多克隆抗體（1∶150），4 ℃孵育過夜,羊抗兔IgG（1∶100）37 ℃孵育30 min，SABC復(fù)合物（1∶100）37 ℃孵育20 min，DAB（中杉金橋）顯色，蘇木精復(fù)染胞核約40 s，中性樹脂封片。0.1%PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.4 蛋白免疫印跡

取保存于-80℃的腎上腺組織100 mg，加入裂解液于玻璃勻漿器中研磨至勻漿狀，12000 r/min、4℃下離心15 min取上清液，即得到蛋白上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒，對所得蛋白上清液進行定量后，5×蛋白上樣緩沖液制樣，沸水煮5 min，-20℃保存?zhèn)溆?，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，加入兔抗NET多克隆抗體（1∶500）或兔抗DβH多克隆抗體（1∶500），4℃孵育過夜，室溫下二抗孵育1.5 h，TBST洗膜后加入化學(xué)發(fā)光底物（Millipore公司），經(jīng)CLINX凝膠成像系統(tǒng)曝光，NET在69 kd處顯示出特異性條帶，DβH在63 kD處顯示出特異性條帶，以β-action的表達水平為內(nèi)參，目的蛋白的表達量以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白平均光密度的對比值表示。

1.5 圖像分析

隨機取正常對照組及各實驗組大鼠腎上腺切片，各取3例。在40倍物鏡下，每例切片隨機選取5個視野。用Image-Pro plus6.0圖像分析系統(tǒng)檢測腎上腺髓質(zhì)細胞內(nèi)NET、DβH陽性細胞的平均光密度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用SNK及LSD法。數(shù)據(jù)以均值±標準差（±s）表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果

光鏡下，DβH、NET免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色細顆粒狀，分布于腎上腺髓質(zhì)細胞胞質(zhì)中。與正常對照組比較，4W、8W、12W、16W及20W各實驗組腎上腺髓質(zhì)細胞內(nèi)DβH、NET免疫染色位置及染色強度未見明顯變化，見圖1、圖2。所有陰性對照組未見陽性反應(yīng)細胞。

圖1 各組大鼠腎上腺髓質(zhì)DβH陽性細胞（SABC法，×400）

圖2 各組大鼠腎上腺髓質(zhì)NET陽性細胞

2.2 圖像分析結(jié)果

與正常對照組相比，4W、8W、12W、16W和20W各實驗組腎上腺髓質(zhì)細胞內(nèi)DβH陽性細胞的平均光密度值未見明顯變化(P＞0.05)。見表1。

與正常對照組相比，4W、8W、12W、16W和20W各實驗組腎上腺髓質(zhì)細胞內(nèi)陽性細胞內(nèi)NET平均光密度值未見明顯變化(P＞0.05)。見表2。

2.3 蛋白免疫印跡結(jié)果及分析

NET、DβH、β-action蛋白分別在69kD、63kD、42kD處顯示出特異性條帶(圖3)。4W、8W、12W、16W及20W各實驗組蛋白表達水平與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05），見圖4、圖5。

3 討論

有研究指出適量飲酒能增強免疫系統(tǒng)功能，對于許多疾病有預(yù)防和治療作用等[10]。但是過多的酒精攝入會帶來一定的負效應(yīng)。NE在腎上腺素交感神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)傳遞中起重要作用。NE信號升高與酒精、尼古丁、海洛因等多種藥物濫用的發(fā)病機制相關(guān)[11]。亦有研究顯示DβH在調(diào)節(jié)酒精相關(guān)行為和身體反應(yīng)中起重要作用[12]。各種應(yīng)激性刺激可使腎上腺嗜鉻顆粒中DβH活性增高，DβH的活性可以反映腎上腺髓質(zhì)的功能狀態(tài)。DβH能有效地將DA轉(zhuǎn)化為NE。當DβH活性降低時，DA/NE比例升高，強烈激活DA受體，從而不能負反饋調(diào)節(jié)NE合成[13]。臨床研究表明，酒精攝入量與NE有關(guān)，急性酒精攝入會影響NE水平，表明NE可能在急性酒精中毒過程中發(fā)揮作用[11]。過量飲酒激發(fā)了個體的應(yīng)激反應(yīng)，激活體內(nèi)的交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)，促使兒茶酚胺類物質(zhì)的釋放，最終引起心率增加、血壓升高。NET屬于單胺類Na+、Cl-依賴性轉(zhuǎn)運蛋白,其功能是將神經(jīng)元釋放的NE再攝取回到突觸前膜中，對調(diào)控突觸間隙中NE濃度、終止神經(jīng)沖動信號、維持受體對神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性極為重要[14]。有研究報道，在腎上腺髓質(zhì)細胞中，NET只存在于去甲腎上腺素能細胞中[15]。酒精主要作用于單胺類轉(zhuǎn)運體，通過阻止轉(zhuǎn)運體對神經(jīng)遞質(zhì)的重吸收，從而增強神經(jīng)遞質(zhì)的興奮作用[16]。

表1 各組大鼠腎上腺髓質(zhì)DβH陽性細胞的平均光密度值 (±s)

表1 各組大鼠腎上腺髓質(zhì)DβH陽性細胞的平均光密度值 (±s)

組別4 W 8 W 12 W 16 W 20 W腎上腺髓質(zhì)DβH陽性細胞平均光密度NCG 0.247±0.012 0.240±0.017 0.248±0.013 0.239±0.013 0.240±0.016 LG 0.220±0.019 0.210±0.011 0.226±0.010 0.233±0.011 0.233±0.015 MG 0.218±0.013 0.207±0.012 0.222±0.012 0.236±0.014 0.231±0.014 HG 0.210±0.013 0.210±0.012 0.220±0.011 0.236±0.017 0.231±0.019

表2 各組大鼠腎上腺髓質(zhì)NET陽性細胞的平均光密度值 (±s)

表2 各組大鼠腎上腺髓質(zhì)NET陽性細胞的平均光密度值 (±s)

組別4 W 8 W 12 W 16 W 20 W腎上腺髓質(zhì)NET陽性細胞平均光密度NCG 0.269±0.016 0.263±0.013 0.267±0.013 0.270±0.013 0.254±0.013 LG 0.236±0.017 0.211±0.012 0.236±0.012 0.269±0.013 0.279±0.013 MG 0.226±0.013 0.229±0.013 0.247±0.012 0.258±0.014 0.287±0.014 HG 0.227±0.015 0.229±0.015 0.236±0.017 0.270±0.012 0.260±0.012

圖3 各組腎上腺髓質(zhì)蛋白表達

圖4 正常對照組及不同劑量白酒灌胃各組大鼠腎上腺組織勻漿中DβH的表達

圖5 正常對照組及不同劑量白酒灌胃各組大鼠腎上腺組織勻漿中NET的表達

本實驗大鼠每次灌胃劑量分為低劑量組0.8 mL/kg·d、中劑量組 1.6 mL/kg·d及高劑量組2.4 mL/kg·d，通過單位換算，相當于正常成年人（60 kg）每日7.8 mL、15.6 mL及23.4 mL的飲酒劑量。在本實驗設(shè)計的劑量下，用該白酒灌胃后，實驗組動物腎上腺髓質(zhì)細胞DβH、NET表達水平對比正常組沒有顯著改變。課題組前期研究成果亦表明，在該劑量下該白酒對大鼠肝細胞、胰島B細胞的表達無明顯影響[17-18]。提示在此劑量下用該白酒灌胃對大鼠腎上腺髓質(zhì)細胞功能而言屬于適量飲酒。

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