潘維強(qiáng) 謝德歡 彭小倩

摘 要 采用MS培養(yǎng)基進(jìn)行叉柱花莖尖組織培養(yǎng)繁殖，建立叉柱花的快速繁殖體系。通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的NAA和6-BA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示培養(yǎng)基配方MS培養(yǎng)基+2 mg·L-1 6-BA+1 mg·L-1 NAA最利于叉柱花的生長(zhǎng)。該研究初步探索叉柱花組織培養(yǎng)繁殖的新方法，可以有效提高叉柱花的繁殖速率，縮短叉柱花的上市時(shí)間，有效補(bǔ)充市場(chǎng)缺口，能夠?yàn)槭袌?chǎng)提供品質(zhì)優(yōu)良的無菌觀賞水草。

關(guān)鍵詞 南美叉柱花；組織培養(yǎng)；快速繁殖；無菌觀賞水草

中圖分類號(hào)：S567.23 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.09.076

觀賞水草是水族缸造景中必不可少的原材料，隨著觀賞水族的快速發(fā)展，觀賞水草的需求量越來越大，各種水草繁殖培育技術(shù)亟待創(chuàng)新[1-2]。南美叉柱花（Staurogyne repens），通常稱作叉柱花，屬爵床科、叉柱花屬，是一種雙子葉植物，原產(chǎn)于巴西、委內(nèi)瑞拉等地，為挺水性水草。南美叉柱花的水上草與水中草外觀基本相同，主要的區(qū)別就是水中草比水上草而定葉片狹小。水中草的葉片呈翠綠色，十字對(duì)生，披針形。莖呈偏棕綠色，整體高度不超過10 cm。叉柱花是近幾年才引入我國(guó)的一種水草，由于其生長(zhǎng)速度慢、植株矮、外觀漂亮，常用作水族缸造景中的前景草，深受人們的喜愛，市場(chǎng)需求火熱，供不應(yīng)求。叉柱花的繁殖主要依靠成體匍匐莖的分株，繁殖速率低，成本高。叉柱花屬短日照植物，在每年11月以后常常開花，引起植物早衰，葉片枯黃，失去觀賞價(jià)值，不僅導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)價(jià)值下降，還會(huì)引起秋冬季節(jié)市場(chǎng)供應(yīng)短缺。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟，已經(jīng)應(yīng)用到了許多花卉、果樹等的苗種繁育，并且實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)[3]，如櫻花[4-5]、彩色馬蹄

蓮[5]、香石竹[5]、金邊鳳梨[6]、網(wǎng)紋草[7-8]等。近年來，一些觀賞水草的生產(chǎn)繁育也成功的運(yùn)用了組織培養(yǎng)技術(shù)，并且優(yōu)點(diǎn)明顯，如紅柳[9]、大水榕[10-11]、小卷浪[12]、珍珠草[12]、長(zhǎng)葉皇冠[13]等，有些已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，但還沒有叉柱花工廠化生產(chǎn)的報(bào)道。組織培養(yǎng)技術(shù)能夠快速繁殖叉柱花，在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的叉柱花苗種，并且在室內(nèi)光照和溫度恒定的狀態(tài)下培育，沒有明顯的季節(jié)變化，避免了光照周期變化而引起的開花[14-15]。此外，利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖的叉柱花在無菌環(huán)境培育而成，經(jīng)過優(yōu)選、脫毒、無菌培育等工序，全程都在無菌環(huán)境下，無病菌侵?jǐn)_，也沒有藻類、害蟲滋生，可塑性強(qiáng)[16]。這就意味著，相比傳統(tǒng)的水上葉和水下葉水草，叉柱花不會(huì)給水族缸帶入病菌，藻類等，可以有效的避免觀賞魚疾病和水族館爆藻。利用組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的叉柱花具有超長(zhǎng)的保鮮時(shí)間。無菌的培養(yǎng)環(huán)境，特殊的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，使水草能在杯內(nèi)存活很長(zhǎng)時(shí)間，所以在長(zhǎng)距離運(yùn)輸、耐保存方面明顯優(yōu)于水上葉和水下葉的水草。此外，組織培養(yǎng)繁殖的叉柱花適應(yīng)能力強(qiáng)，轉(zhuǎn)水快，不易溶葉。本研究通過對(duì)叉柱花組織培養(yǎng)技術(shù)的探索，以期為叉柱花的工廠化快速繁育提供技術(shù)方案，提高市場(chǎng)供應(yīng)量。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年10月采自蠡園實(shí)驗(yàn)室自然繁育的水上葉的叉柱花，選用植株粗壯、健康的成品叉柱花作為外植體。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用無蔗糖的MS培養(yǎng)基，在其中添加適量的NAA、6-BA以及30 g·L-1蔗糖、8 g·L-1瓊脂，pH值調(diào)至5.8±0.2，經(jīng)高壓滅菌鍋121 ℃高壓滅菌20 min。培養(yǎng)條件：日溫26 ℃，夜溫22 ℃，濕度65%～80%，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時(shí)間10 h/d。

1.3 外植體的消毒和滅菌

選取叉柱花幼嫩的帶腋芽的莖段作為外植體，剪去葉片，用自來水流水沖洗1 min，然后在培養(yǎng)皿中將材料浸泡在煮沸冷卻的水中，用毛筆刷洗，重復(fù)3次，每次更換水。再用淡肥皂水浸泡10 min，取出，用自來水沖洗

1 min，然后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)中，用75%酒精在無菌燒杯中浸泡外植體6～10 s，再用0.1%升汞消毒9 min，浸泡時(shí)不斷的搖晃外植體，以避免外植體上有氣泡的產(chǎn)生，接著用無菌水沖洗6次，得到無菌外植體備用。

1.4 建立叉柱花無菌體系

配制6個(gè)NAA+6-BA組合不同濃度的培養(yǎng)基，用錐形瓶盛裝，每個(gè)類型4瓶，共24瓶，激素濃度組合分為6種，編號(hào)為1～6，6-BA∶NAA（mg·L-1）濃度分別為0.5∶0.1、1∶0.1、2∶0.1、0.5∶0.2、1∶0.2、2∶0.2。把消毒好的外植體切成帶腋芽小段，接種至培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)生長(zhǎng)，經(jīng)過15 d的生長(zhǎng)后獲得無菌苗，通過觀察幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)初步確定其激素最適濃度配比。

1.5 叉柱花的擴(kuò)繁

將獲得的無菌苗拆成單株幼芽接種至新配培養(yǎng)基中確定NAA+6-BA的最適配比。配制4種培養(yǎng)基，編號(hào)1～4，使用錐形瓶盛裝，每種4瓶，激素濃度組合NAA∶6-BA（mg·L-1）分別為0.2∶1、0.5∶1、1∶1、1.5∶1。經(jīng)過20 d的生長(zhǎng)，比對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.6 叉柱花的移植

當(dāng)恒溫培養(yǎng)箱中叉柱花幼苗長(zhǎng)至苗高2 cm、根1 cm時(shí)，便可移出培養(yǎng)箱，在室內(nèi)煉苗培養(yǎng)7 d，即可轉(zhuǎn)入傳統(tǒng)水草培養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)生產(chǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌體系的建立與誘芽

無菌體系一旦建立，便可通過擴(kuò)繁不斷的繼代增殖培養(yǎng)，在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的無菌苗，如圖1所示。在建立無菌體系的過程中，設(shè)定梯度較大的6-BA，而NAA只有兩個(gè)濃度，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出植株根系都不發(fā)達(dá)，而植株不定芽的生長(zhǎng)狀態(tài)隨著6-BA濃度的增加而表現(xiàn)的愈加良好，但是隨著濃度增加，不定芽的密度過密不利于后期實(shí)驗(yàn)操作，所以選定1mg/L的濃度作為最適添加濃度。

無菌體系培養(yǎng)過程中，編號(hào)1培養(yǎng)基芽較少、粗壯，根很少、細(xì)??；編號(hào)2培養(yǎng)基芽較多、均勻，根很少、細(xì)?。痪幪?hào)3培養(yǎng)基芽多、較短、密集，根很少、細(xì)?。痪幪?hào)4培養(yǎng)基芽較少、粗壯，根很少、短??；編號(hào)5培養(yǎng)基芽較多、均勻，根很少、短??；編號(hào)6培養(yǎng)基芽多、較短、密集，根很少、短小。

2.2 叉柱花的擴(kuò)繁與生根培養(yǎng)

將無菌體系獲得的植株直接分株接入新制培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d后，觀察生根情況，如圖2所示。結(jié)果顯示0.2～1.5 mg·L-1濃度的NAA都能誘導(dǎo)生根，但是差別很大，0.2 mg·L-1濃度的根生長(zhǎng)情況很差，根數(shù)目少而短小，而0.5 mg·L-1條件下的均勻，數(shù)目較多，長(zhǎng)度適中，隨著濃度的增加，1～1.5 mg·L-1根生長(zhǎng)的長(zhǎng)度越來越長(zhǎng)，數(shù)目也有所增加。所以結(jié)果顯示0.5 mg·L-1時(shí)的NAA濃度最合適。

2.3 無菌苗的分煉和移栽

掌握NAA+6-BA最佳組合添加濃度后，后續(xù)擴(kuò)繁生產(chǎn)都使用0.5 mg·L-1 NAA+1 mg·L-1 6-BA的添加量配置的培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d左右，叉柱花幼苗一般株高2 cm，根長(zhǎng)1 cm，此時(shí)可以移栽到室內(nèi)，經(jīng)過7 d左右的生長(zhǎng)，可上市?；蛘叻譄捯圃灾翜?zhǔn)備好的特制無菌水草杯，制成無菌杯草，同樣培養(yǎng)7 d左右可上市。

3 討論

國(guó)內(nèi)觀賞水草多引自國(guó)外，大多數(shù)來自南美洲、非洲、東南亞等熱帶地區(qū)[17]。觀賞水草需求量越來越大，已發(fā)展為一種重要的產(chǎn)業(yè)，但許多水草繁育難度大、要求高。廣東省廣州市是我國(guó)進(jìn)口水草的最大集散地，同時(shí)廣東省也是國(guó)內(nèi)最大的觀賞水草產(chǎn)地，得益于得天獨(dú)厚的氣候條件，熱帶水草能夠在這里繁育，而在北方，水草產(chǎn)量較低[18]。因此天然條件對(duì)水草生產(chǎn)有著很大的影響。運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)則可以開發(fā)出更多種類的水草繁育方法，恒定的培養(yǎng)條件可以解除地域?qū)λ萆a(chǎn)的限制。恒定的環(huán)境條件還可以有效的改變水草生長(zhǎng)周期，對(duì)叉柱花來說，可以防止它冬天開花現(xiàn)象的出現(xiàn)，從而消除季節(jié)性的供應(yīng)，可以長(zhǎng)期連續(xù)的對(duì)市場(chǎng)提供叉柱花。組織培養(yǎng)技術(shù)可以相對(duì)縮短叉柱花生產(chǎn)周期，快速獲得成品植株，對(duì)提高上市產(chǎn)量有著重要意義?，F(xiàn)在的組織培養(yǎng)技術(shù)非常成熟，只是生產(chǎn)成本關(guān)系到它的應(yīng)用范圍。在組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)中，建立無菌體系和增殖效率是關(guān)鍵，植物外植體通常包含有許多內(nèi)生和外生細(xì)菌，在培養(yǎng)過程中無菌材料尤為關(guān)鍵。要嚴(yán)格把控外植體在個(gè)處理步驟中的處理時(shí)間，不宜過長(zhǎng)或過短，處理時(shí)間過短則有可能除菌效果差，處理時(shí)間過長(zhǎng)又可能導(dǎo)致外植體活性變差，影響培養(yǎng)生長(zhǎng)[12]。本研究通過設(shè)置簡(jiǎn)單的梯度獲得適合的NAA+6-BA組合，兩種激素成本較低，效果理想，完全適合叉柱花的快速繁殖生產(chǎn)。將培養(yǎng)基盛入定制的水草杯中，在后期分煉移栽中可以生產(chǎn)出無菌叉柱花，直接上市，這種無菌水草發(fā)展前景十分良好，在未來無菌水草很有可能代替一部分傳統(tǒng)方法繁育的水草，對(duì)觀賞水草行業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

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（責(zé)任編輯：趙中正）