陳群英，鄭馬慶

(1.南京工業(yè)大學(xué) 江蘇省藥物研究所，江蘇 南京 210009；2.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211816)

苯甲醇，英文名為Benzyl alcohol，是醫(yī)藥合成的重要中間體，是最簡單的含有苯基的脂肪醇。有微弱的芳香氣味，稍溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑[1-2]。苯甲醇具有中等抗菌活性，可以抑制革蘭氏陽性菌、霉菌和酵母菌。而且具有麻醉、鎮(zhèn)痛的功效。因此可以作為藥用輔料，應(yīng)用于藥膏或藥液中[3]。 苯甲醇收載于FDA《非活性組分指南》(用于注射劑，口服膠囊劑，溶液劑和片劑，局部、陰道用制劑)。在英國準(zhǔn)許用于注射與非注射用制劑[4-5]。在應(yīng)用于注射劑時(shí)，有必要對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量進(jìn)行測(cè)定。本研究依據(jù)《中國藥典》2015年版第四部“1100生物檢查法”項(xiàng)下“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行干擾試驗(yàn)，建立苯甲醇的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，并利用凝膠半定量法對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)。

1 儀器、試劑與藥品

1.1 儀器

旋渦振蕩器 (VORJEXII)，由海門市其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)；干式恒溫器(DC3A)，由南京三愛斯技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(DGF30)，南京市實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)；移液器(1000μL、100μL)，Eppendorf。

1.2 藥品

苯甲醇，批號(hào)100-51-6，純度99.99%，密度1.047 g/mL，由湖北綠色家園精細(xì)化工股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(WSE)，規(guī)格80EU/支，批號(hào)150601-201681，由中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET)，批號(hào)1504200，規(guī)格5 mL/支，由湛江博康海洋有限公司生產(chǎn)；鱟試劑1(TAL1),規(guī)格0.1 mL/支，靈敏度0.125 EU/mL，批號(hào) 1503201，由湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)；鱟試劑2(TAL2),規(guī)格0.1 mL/支，靈敏度0.125EU/mL，批號(hào)1412010，由湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

參照《中國藥典》2015年版第四部“1100生物檢查法”項(xiàng)下“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行，將兩個(gè)廠家、兩批鱟試劑(標(biāo)示靈敏度均為0.125EU/mL)進(jìn)行靈敏度復(fù)核試驗(yàn)，結(jié)果表明鱟試劑靈敏度符合要求，測(cè)定靈敏度均為標(biāo)示靈敏度。結(jié)果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值L

根據(jù)公式L=K/M，其中K為人用每千克每小時(shí)可接受的最大細(xì)菌內(nèi)毒素劑量，其中注射劑為5EU/(kg·h)。M為供試品每千克每小時(shí)的最大劑量。根據(jù)世界衛(wèi)生組織規(guī)定人體每日攝入苯甲醇最高為5 mg/kg。根據(jù)公式計(jì)算得苯甲醇內(nèi)毒素限值L為1EU/mg。

2.3 最大有效稀釋倍數(shù)MVD

本研究選用靈敏度為0.125EU/mL鱟試劑，根據(jù)公式MVD=cL/λ，計(jì)算當(dāng)λ為0.125EU/mL時(shí)，液體注射劑c取1，MVD為8000倍。

2.4 干擾試驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)

取苯甲醇，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別稀釋50、100、250、500、1000倍，苯甲醇終濃度分別為20.49、10.47、4.188、2.094、1.047mg/mL，將此系列濃度的溶液記為NPC；用含0.25EU/mL(2λ)的檢查用水將苯甲醇稀釋50、100、250、500、1000倍，苯甲醇終濃度分別為20.49、10.47、4.188、2.094、1.047mg/mL，且含0.25EU/mL的細(xì)菌內(nèi)毒素，將此系列濃度的溶液記為PPC。

取靈敏度為0.125EU/mL的兩個(gè)不同廠家的鱟試劑，分別與上述NPC、PPC進(jìn)行反應(yīng)，每一濃度重復(fù)兩管，并設(shè)置陽性和陰性對(duì)照。結(jié)果見表2。

表2 干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明，苯甲醇在稀釋至濃度4.188 mg/mL(此時(shí)對(duì)應(yīng)苯甲醇稀釋倍數(shù)為250倍)及以下時(shí)，對(duì)兩個(gè)廠家鱟試劑均無抑制作用。

2.5 干擾試驗(yàn)

用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將苯甲醇稀釋成終濃度為2.094mg/mL(稀釋500倍)的供試品溶液。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET)和終濃度為2.094mg/mL的供試品溶液分別將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0.25、0.125、0.06、0.03EU/mL的溶液(分別稱為BET系列以及樣品系列)，參照《中國藥典》2015年版第四部“1100生物檢查法”項(xiàng)下“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行，并設(shè)置供試品溶液及BET陰性對(duì)照。結(jié)果見表3。

表3 干擾試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(λ=0.125)

試驗(yàn)結(jié)果表明，用兩種廠家的鱟試劑，Es均為1λ，Et均為1Es，符合中國藥典對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有效性(0.5λ

2.6 苯甲醇樣品檢測(cè)

采用凝膠半定量實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將苯甲醇(批號(hào)100-51-6)稀釋成終濃度為2.094 mg/mL的供試品溶液。按表4進(jìn)行檢測(cè)。

表4 苯甲醇凝膠半定量細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果表明，苯甲醇細(xì)菌內(nèi)毒素<0.06EU/mg。

3 討論

1968年Bang和Levin[6]發(fā)現(xiàn)鱟血凝聚機(jī)制，并建立用鱟試劑檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)方法,經(jīng)過世界各國研究人員的不懈努力，利用鱟血檢測(cè)藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。該法具有經(jīng)濟(jì)、簡便、快速、特異性強(qiáng)及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，逐漸取代了傳統(tǒng)的家兔熱源測(cè)試法，現(xiàn)在各國藥典已收載了凝膠法和廣度法用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)[7]。鱟試劑的最適反應(yīng)pH

值一般為6.0～8.0，過酸或者過堿會(huì)對(duì)反應(yīng)起干擾作用。此外，一些干擾因子如脂多糖等也會(huì)產(chǎn)生干擾出現(xiàn)假陽性反應(yīng)[8-9]。因此，在實(shí)際的應(yīng)用中，需排除干擾，進(jìn)行方法可行性研究。本研究利用逐步稀釋法，建立苯甲醇的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法。結(jié)果表明，苯甲醇在濃度為10.47 mg/mL及以上時(shí)，會(huì)對(duì)反應(yīng)起干擾作用，而繼續(xù)稀釋至4.188mg/mL時(shí)，干擾消除。為保險(xiǎn)起見，選用2.094 mg/mL，進(jìn)行干擾試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，苯甲醇在濃度為2.094 mg/mL時(shí)對(duì)兩個(gè)廠家的鱟試劑均無干擾作用。利用凝膠半定量法進(jìn)行苯甲醇內(nèi)毒素含量測(cè)定，測(cè)得苯甲醇細(xì)菌內(nèi)毒素小于0.06EU/mg，符合規(guī)定。

[1]易 巧,劉旭平,張銀花.藥用輔料苯甲醇新版藥典微生物限度檢查適用性試驗(yàn)[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新2017,14(4):48-52.

[2]廖 彬,劉雁鳴,龍海燕,等.氣相色譜法測(cè)定藥用輔料苯甲醇的有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥師,2015,18(8):1315-1319.

[3]吳鑫干,李陵嵐.苯甲醇制造方法[J].工業(yè)催化,2002,10(2):26-32.

[4]姚 靜.輔料應(yīng)用指南[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2011:157-159.

[5]Raymond C Rowe,Paul J Sheskey,Marian E Quinn.Handbook of Pharmaceutical Excipients [M].6th Edition.London Chicago: the Pharmaceutical press and the American Pharmacists Association,2009: 64-66.

[6]Levin J,Bang F B.Clotlable protein in limulus:its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin[J].Thromb Diath Haemorrh,1968,19:186-189.

[7]王 莉,高 華,蔡 彤,等.鱟試劑的研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].藥物分析雜志,2007,27(6):938-942.

[8]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典藥典2015年版(四部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:154-157.

[9]王麗華.艾迪注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法探討[J].生物技術(shù)通訊,2011,22(6):870-872.

(本文文獻(xiàn)格式：陳群英，鄭馬慶.藥用輔料苯甲醇細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)研究[J].山東化工,2018,47(7):68-69,72.)