魏玉倩 唐 婕 普曉蘭 伍建榕 童亞麗 楊植芳

(1. 西南林業(yè)大學(xué)國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點實驗室，云南 昆明 650224；3. 云南云投生態(tài)環(huán)境科技股份有限公司，云南 昆明 650217；4. 西雙版納印奇生物資源開發(fā)有限公司，云南 西雙版納 666100)

星油藤(Plukenetiavolubilis)也稱印奇果，南美油藤，大戟科多年生藤本植物，原產(chǎn)南美洲安第斯山脈地區(qū)熱帶雨林[1]。2006年從秘魯引入，交中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園試種。2008年試種成功，并在西雙版納、紅河、臨滄等地推廣種植。截至2015年末，印奇果公司已在西雙版納普文鎮(zhèn)建成了80 hm2印奇美藤果良種繁育及試驗基地。境內(nèi)印其美藤果推廣種植650余hm2，境外老撾、越南、泰國已完成合作推廣種植印其果種植4 000余hm2。2015年初，種植人員在星油藤種植產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)多年生星油藤植株大量死亡，癥狀起初表現(xiàn)為植株上部分葉片由綠變黃，懸掛在樹枝上，經(jīng)仔細觀察發(fā)現(xiàn)，星油藤根基部及根部腐爛。后期，植株整株干枯死亡。大田種植中根腐病發(fā)生嚴重，常出現(xiàn)星油藤根莖腐爛和植株死亡，發(fā)生面積廣，造成損失較為嚴重，病死株率達到50%～70%，個別種植園甚至達80%。但無論是原產(chǎn)地還是其他種植產(chǎn)區(qū)，關(guān)于星油藤根腐病的病原菌的研究均較少。為明確星油藤根腐病的致病菌種類，采用組織分離法、單孢分離法對病原菌進行分離，依據(jù)形態(tài)學(xué)特征和柯赫氏法則、分子生物學(xué)鑒定方法對星油藤根腐病的病原進行系統(tǒng)研究，為星油藤根腐病的有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源與試劑

1) 樣本采集及病原菌獲得。2016年3月—2017年3月分別在西雙版納星油藤種植基地，4次采集星油藤根腐病發(fā)病植株，保濕培養(yǎng)帶回實驗室，取病根部病健交界部分進行分離純化。

2) 培養(yǎng)基及試劑。供試培養(yǎng)基為馬鈴薯瓊脂固體培養(yǎng)基 (PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。真菌DNA抽提試劑盒HP Fungal DNA Kiter (50)。真菌通用引物：ITS1：5′ TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3′；ITS4：5′ TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3′。2 × Taq Master Mix (近岸蛋白質(zhì)科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1菌株分離純化保存

1) 病原菌的分離培養(yǎng)。病原菌分離主要參照方中達的方法[2]，實驗前制備PDA培養(yǎng)基并將所需的材料置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，在無菌操作臺上切取根部病健交界處5 mm × 5 mm的組織，先置于70%乙醇中表面消毒10～15 s，然后在0.1%升汞中深層消毒1～6 min，再用無菌水中漂洗2～3次，最后置于PDA培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放4塊，設(shè)置3個重復(fù)，25 ℃黑暗培養(yǎng)，待菌塊病原長出菌絲后挑至PDA中純培養(yǎng)，觀察記錄菌落形態(tài)及顏色和病原菌的形態(tài)特征[3]。

2) 病原菌保存。將純化得到的菌株培養(yǎng)至PDA斜面培養(yǎng)基中，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2致病菌的致病性測定

將星油藤根腐病分離純化后的病原菌轉(zhuǎn)至PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，挑取新鮮菌絲置于PDA培養(yǎng)基中，置于搖床內(nèi)培養(yǎng)7 d，待菌擴繁后澆于健康植株上。同時設(shè)噴澆清水為空白對照，每個處理重復(fù)30次。接種后放置于溫室大棚內(nèi)培養(yǎng)，觀察植株生長情況并記錄。待植株發(fā)病后再次按上述方法進行分離培養(yǎng)，觀察病原菌形態(tài)特征[4]。

1.2.3菌株分子鑒定

用75%乙醇殺菌消毒挑針并于火焰上灼燒，挑取黃豆大小的菌絲置于離心管中，切記挑到培養(yǎng)基，用鑷子夾取放于液氮中，用攪棍棒攪碎。采用真菌DNA抽提試劑盒提取病菌DNA，轉(zhuǎn)錄區(qū)擴增采用通用真菌通用引物ITS1、ITS4，PCR擴增體系為2 × Taq Master Mix 25 μL，ddH2O 20 μL，ITS1 1.5 μL，ITS4 1.5 μL，DNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存[5]。把擴增后序列送至碩陽科技有限公司測序，將測序得到的特異性區(qū)間序列在NCBI進行比對得到同源性最高的相似菌種，最后分析實驗結(jié)果。

1.2.4系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測序結(jié)果輸入至NCBI中進行序列比對，下載同源性最高的序列，導(dǎo)入MEGA中，基于ITS序列和Neifhbour-Joining分析方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 星油藤根腐病癥狀特點

病原菌主要侵染星油藤根部，受害植株地上部分癥狀表現(xiàn)為葉片發(fā)育受阻，葉形變小，枝葉稀疏，葉變黃、早落，最終導(dǎo)致整株枯死。挖出根部可見病樹根及根莖部皮層腐爛，同時皮層與木質(zhì)部間偶有白色菌絲存在。病原致病性測定后地上部分與地下部分癥狀與野外調(diào)查癥狀一致，依次出現(xiàn)初期葉片失去光澤，部分葉片變黃，后期葉片脫落，長勢衰弱，根部皮層腐爛，并有白色菌絲出現(xiàn) (圖1)。

a為正常植株；b、c為發(fā)病植株。

圖1星油藤根腐病癥狀
Fig.1 The symptom ofP.volubilisroot rot

2.2 星油藤根腐病病原菌分離

分離純化后的病原菌在PDA培養(yǎng)基上25 ℃黑暗培養(yǎng)4 d后的菌落直徑4 cm，菌落形態(tài)棉絮狀，初為白色，后逐漸變?yōu)榉奂t色，氣生菌絲生長速度快 (見圖2a、b)，小型分生孢子多卵圓形，大型分生孢子鐮刀狀，兩端尖，多數(shù)3～5個分隔 (見圖2c)。

圖2尖孢鐮刀菌形態(tài)學(xué)特征
Fig.2 The morphological characteristics ofF.oxysporum

2.3 星油藤根腐病致病菌測定及病原重分離

將分離純化后病原菌的孢子懸浮液澆于健康植株根部，接菌22 d后發(fā)現(xiàn)植株地上部分開始出現(xiàn)癥狀。2組試驗中：第1組30株中有28株顯癥，病株率達93.33%；第2組30株中有26株顯癥，病株率達86.66%。顯癥植物樹勢變?nèi)?，葉片變黃，根部出現(xiàn)根部腐爛，在木質(zhì)部和皮層間可見白色菌絲；清水對照無發(fā)病癥狀。病株經(jīng)再次分離培養(yǎng)純化后，獲得相同菌落，通過誘導(dǎo)產(chǎn)孢，經(jīng)顯微鏡觀察鑒定，人工接種植株上分離得到的病原菌與野外發(fā)病植株上分離的病原菌菌落形態(tài)、孢子形態(tài)大小及分子鑒定均一致。供試病原菌對星油藤根腐病具有普遍致病性，發(fā)病的植株根部變色，壞死，同時，設(shè)清水對照不表現(xiàn)癥狀。菌株XYTGF10致病性較弱，發(fā)病率達到86.66%，菌株XYTGF9致病性更強，發(fā)病率達到92.20%。方差結(jié)果表明，菌株XYTGF9和XYTGF10均與對照存在顯著差異。

2.4 星油藤根腐病病原菌ITS分子鑒定結(jié)果

擴增病原菌ITS-rDNA基因，獲得長度為550～650 bp的DNA片段。序列測定并比對結(jié)果表明，供試菌株基因組ITS-rDNA序列與NCBI庫內(nèi)的尖孢鐮刀菌 [Fusariumoxysporum(GenBank登錄號為JN400718.1)] 同源性達到99%。據(jù)此確認該病原菌為尖孢鐮刀菌，屬半知菌類瘤座菌目，同時基于ITS序列和NJ分析方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可以看出這2個菌株在該類群中的位置，見圖3。菌株XYTGF9與EU246679聚類在一起；XYTGF10與EU246687聚類在一起，進一步證明該病原菌的分類地位。

圖3 基于ITS序列和NJ分析方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree based on ITS sequences with NJ

3 結(jié)論與討論

在真菌的分類鑒定中，長期以來一直以形態(tài)特征為主要依據(jù)，而許多真菌的形態(tài)特征復(fù)雜難以觀察，以及受環(huán)境條件的影響而不穩(wěn)定的原因，給真菌的分類鑒定，尤其是種及種以下的分類鑒定帶來一定的難度。近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，真菌的分類學(xué)已從表型分型進入基因分型的新時代，已經(jīng)為人們從分子水平上對真菌進行分類鑒定提供了有利手段。目前對真菌核糖體DNA (rDNA) 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間各區(qū) (ITS) 進行PCR擴增、測序及序列分析的方法來鑒定真菌病原，由于快速準(zhǔn)確，已被廣泛應(yīng)用[6]。國外在真菌rDNA基因間隔區(qū)段的序列測定的研究，集中在小核菌 (Sclerotiumsp.)、白粉菌科 (Erysiphaceae)、腐霉菌 (Phythirumsp.) 和蜜環(huán)菌 (Armillariasp.) 等[7]。在星油藤根腐病病原鑒定中，在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，結(jié)合分子生物學(xué)鑒定的方法，采用rDNA-ITS序列分析的方法將病原真菌鑒定到種水平。查閱相關(guān)文獻[8]，未見有關(guān)尖孢鐮刀菌引起星油藤根腐病的報道。許銳曾報道尖孢鐮刀菌 (Fusariumoxysporum) 可引起香莢蘭根腐病[9]。本研究通過對病原菌的分離培養(yǎng)，結(jié)合分子鑒定技術(shù)，準(zhǔn)確測定出病害的病原為尖孢鐮刀菌。在致病性鑒定中發(fā)現(xiàn)濕度、溫度較高的情況下，會加重病害的發(fā)生發(fā)展。尖孢鐮刀菌為典型的土傳病害真菌，屬土壤習(xí)居菌，是一類在土壤和有機質(zhì)中數(shù)量多而活躍的病原真菌[10]。

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