華 梅 王 垚 肖支葉 原曉龍 虞 泓 王 娟 楊宇明 王 毅

(1. 云南省林業(yè)科學院，云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室/國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育實驗室，云南 昆明 650201；2. 云南大學中草藥生物資源研究所云百草實驗室，云南 昆明 650091；3. 西南林業(yè)大學材料工程學院，云南 昆明 650224)

天然產(chǎn)物是新藥物分子和先導化合物的重要來源，目前大量天然產(chǎn)物已被發(fā)現(xiàn)，已知物屢被重復分離的現(xiàn)象直接制約著新藥物的發(fā)展。蟲生真菌[1]能產(chǎn)生萜類、生物堿、甾體、醌類、肽類、內(nèi)酯、酚類等化合物，具有抗腫瘤、抗菌、抗瘧、抗動脈粥樣硬化、抗真菌、抗癌等多種生物活性[2-3]。Li等[4]從直翅目中分離出層生鐮刀菌 (Fusariumproliferatum)，并從其發(fā)酵培養(yǎng)液乙酸乙酯提取物中分離并鑒定出具有抑菌活性的聚酮類物質(zhì)。楊新洲等[5]從斑蝥 (Lyttavesicatoria) 體內(nèi)分離得一株具有顯著抗肝癌活性的真菌菌株 (Fusariumoxysporum)，表明從菌株發(fā)酵液提取物乙酸乙酯部位中分離得到的cyclo (R-Pro-S-Phe) 對2個肝癌細胞株Hep G2和SMMC-7721均有抑制作用。Lu等[6]從蜻蜓體內(nèi)分離得到土曲霉 (Aspergillusterreus) QT122菌株，并從其中分離出5種具有抗真菌和免疫抑制作用的化合物。對蟲生真菌次生代謝產(chǎn)物的研究不僅發(fā)現(xiàn)了更多結(jié)構(gòu)新穎的化合物，也有助于具有藥理活性的化合物的發(fā)掘[7-8]。

蟲草無性型之一的綠僵菌 (Metarhizium)，是具有潛在開發(fā)價值的昆蟲病原真菌，現(xiàn)已開發(fā)為多種真菌殺蟲劑[9-10]。通過對綠僵菌代謝產(chǎn)物中化學成分及活性進行研究發(fā)現(xiàn)，綠僵菌代謝產(chǎn)物中含有聚酮化合物[11]、異香豆素苷[12]、苦馬豆素[13]、生物堿[14]等化學成分，具有清除自由基、提高免疫力、抑制腫瘤、抗突變、抗輻射、抗氧化等生物活性[15-18]；大蟬蟲草發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物對白色念珠菌 (Candidaalbicans) 有明顯的抑制作用[19]。戴氏蟲草 (Cordycepstaii) 無性型—戴氏綠僵菌 (Metarhiziumtaii) 88-601菌株菌絲體乙醚浸提液對革蘭氏陽性菌，如金黃色葡萄球菌 (Staphyloccusaureus)、枯草桿菌 (Bacillussubtilis) 有明顯的拮抗作用[20-21]，從戴氏蟲草菌絲體培養(yǎng)物中分離并鑒定出具有抗菌活性之一的化合物為煙曲霉酸[22-23]。

目前，對貴州綠僵菌 (Metarhiziumguizhouense) 的研究主要集中在液體深層培養(yǎng)分生孢子[10]和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶[24]方面，尚無對其培養(yǎng)物抗菌活性的研究。前期對蟲草中幾種綠僵菌培養(yǎng)物的提取物抑菌活性篩選實驗中發(fā)現(xiàn)，貴州綠僵菌的液體培養(yǎng)提取物也具有一定的抑菌活性。為了進一步對貴州綠僵菌培養(yǎng)物抑菌活性進行深入的研究，在貴州綠僵菌抑菌活性篩選的基礎上，采用OSMAC策略，研究不同碳源、氮源、接種量、不同接種時間對貴州綠僵菌菌絲體提取物抑菌活性的影響，同時對貴州綠僵菌產(chǎn)生的抑菌提取物的熱、光及酸堿穩(wěn)定性進行了測定，為尋找貴州綠僵菌中具有抑菌活性的化合物及后續(xù)大量培養(yǎng)和分離貴州綠僵菌抑菌化合物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1供試菌株

本實驗采用的致病菌有蠟樣芽孢桿菌 (B1) (Bacilluscereus)、藤黃微球菌 (B2) (Micrococcusluteus)、緩慢芽孢桿菌 (B3) (Bacilluslentus)、副溶血性弧菌 (B4) (Vibrioparahaemolyticus)、溶血性葡萄球菌 (B5) (Straphylococcushaemolyticus)、銅尿假單胞菌 (B6) (Pseudomonasaeruginosa)、乙型副傷寒沙門氏菌 (B7) (Salmonellaparatyphi)、無乳鏈球菌 (B8) (Streptcococcusagalactiae)、短小芽孢桿菌 (B9) (Bacilluspumilus)、福氏志賀氏菌 (B10) (Shigellaflexneri)、枯草芽孢桿菌 (B11)、金黃色葡萄球菌 (B12)、大腸埃希菌 (B13) (Escherichiacoli)。

1.1.2培養(yǎng)基

氮源培養(yǎng)基 以6 g/L的葡萄糖 (G)、蔗糖 (S) 為碳源，分別以4 g/L的麥芽浸粉 (M1)、酵母粉 (Y2)、番茄浸粉 (T)、馬鈴薯浸粉 (P)、大豆蛋白胨 (S)、胰蛋白胨 (Y1)、牛肉浸粉 (B)、酪蛋白胨 (L)、香蕉粉 (B1)、麥芽浸粉肉湯 (M2)、大豆蛋白胨和酵母粉 (SY2) 配制成碳源相同、氮源不同的11種濃度一致液體培養(yǎng)基，即GSM1、 GSY2、 GST、 GSP、 GSS、 GSY1、 GSB、 GSL、 GSB1、 GSM2、 GSSY2。

碳源培養(yǎng)基 以6 g/L S、Y2為氮源，分別以4 g/L的甘露醇 (Man)、麥芽糖 (Mal)、山梨醇 (Sor)、蔗糖 (Suc)、乳糖 (Lac)、葡萄糖 (Glu)、肌醇 (Ino)、果糖 (Fru)、可溶性淀粉 (Sta) 配制成氮源相同、碳源不同的9種濃度一致液體培養(yǎng)基，即ManY2S、 MalY2S、SorY2S、SucY2S、LacY2S、GluY2S、InoY2S、FruY2S、StaY2S。

OMAM液體培養(yǎng)基能同時提供大豆蛋白胨和酵母2種氮源，且碳源用量較大能促進菌絲體快速增長。MY固體培養(yǎng)基用于活化貴州綠僵菌，以利于后續(xù)液體培養(yǎng)的研究。

1.2 實驗方法

1.2.1貴州綠僵菌初期液體培養(yǎng)基的篩選

配制MY固體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，在無菌條件下，鉤取已經(jīng)鑒定好的母種接于斜面培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，待菌絲長滿斜面后用于菌絲體的液體培養(yǎng)。將貴州綠僵菌分別接種于100 mL OMAM、MY、PDA液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min搖床中培養(yǎng)10天，并分別設置不接種貴州綠僵菌的100 mL OMAM、MY、PDA液體培養(yǎng)基為CK。

1.2.2貴州綠僵菌液體培養(yǎng)物的提取

分別在貴州綠僵菌液體培養(yǎng)物及CK中加入100 mL乙酸乙酯，振蕩混勻，于室溫下超聲提取1 h。將綠僵菌提取液倒入4層紗布中過濾，去除綠僵菌菌絲體。濾液在分液漏斗中混合均勻，靜置過夜分液，后取上層液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮致干，稱質(zhì)量，加入二甲基亞砜 (DMSO) 做抗菌活性篩選。

1.2.3貴州綠僵菌培養(yǎng)物抑菌活性測定

13種供試細菌菌株懸浮液的制備、濾紙片法篩選綠僵菌提取物的抑菌活性及二倍稀釋法對最低抑菌活性 (MIC) 測定方法參照文獻 [25-26]。

1.2.4貴州綠僵菌抗菌提取物穩(wěn)定性測定

用DMSO配制15份50 mg/mL貴州綠僵菌提取物溶液，用于貴州綠僵菌抑菌提取物穩(wěn)定性實驗。

光穩(wěn)定性檢測 將5份貴州綠僵菌提取物溶液分別置于紫外燈光下照射30、60、90、120、150 min，測定抑菌活性。

熱穩(wěn)定性檢測 將5份貴州綠僵菌提取物分別在30、50、70、90、100 ℃下水浴處理30 min，測定抑菌活性。

酸堿穩(wěn)定性實驗 將5份貴州綠僵菌提取物的pH分別調(diào)為3、5、7、9、11，測定抑菌活性。穩(wěn)定性試驗均平行做3次，取平均值用于試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。

1.2.5不同培養(yǎng)條件下菌絲體提取物抑菌實驗

采用OSMAC策略的方法，將貴州綠僵菌分別接種于11種不同氮源培養(yǎng)基和9種不同碳源培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)10天，提取培養(yǎng)物做活性實驗，用于不同碳氮源培養(yǎng)基的篩選。稱取1.5 g菌絲體，打碎，用10 mL滅菌蒸餾水稀釋，獲得菌絲體懸濁液。在100 mL OMAM培養(yǎng)液中分別加入300 μL、500 μL、1 mL、1.5 mL、2.0 mL菌絲體懸濁液，用于研究接種量對菌絲體提取物抗菌活性的影響。在OMAM培養(yǎng)基中接種貴州綠僵菌5份，分別培養(yǎng)5、10、15、20、25 d，用于研究培養(yǎng)時間對菌絲體抑菌活性的影響。將不同培養(yǎng)處理的培養(yǎng)液用乙酸乙酯等體積超聲萃取3次，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，將每份提取物稱量，分別配制成50 mg/mL的DMSO溶液，用紙片法檢測其活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 貴州綠僵菌提取物抑菌活性及最低抑制濃度

貴州綠僵菌分別經(jīng)OMAM、MY、PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)貴州綠僵菌在OMAM培養(yǎng)基中生長的最快。菌絲體培養(yǎng)液經(jīng)乙酸乙酯超聲處理后，OMAM、MY、PDA培養(yǎng)基中干提取物得率分別為121、85、77 mg/100 mL。將OMAM培養(yǎng)后得到的提取物進行抑菌試驗，結(jié)果表明貴州綠僵菌粗取物能對B1、B3、B5產(chǎn)生抑制作用，抑菌圈直徑分別為10.2、11.3、10.0 mm，可見貴州綠僵菌經(jīng)OMAM液體培養(yǎng)后能產(chǎn)生具有抑菌活性的化合物。貴州綠僵菌提取物對3種細菌的最低抑制濃度分別為6.25、1.56、6.25 mg/mL，其中對B3的最低抑制濃度最低，可見貴州綠僵菌培養(yǎng)物中抑菌化合物對B3具有較高的敏感性。

2.2 貴州綠僵菌抗菌提取物穩(wěn)定性分析

2.2.1光穩(wěn)定性分析

由圖1可知，光照處理后，貴州綠僵菌的提取物對3種細菌依然具有活性。隨著光照時間的增加，貴州綠僵菌提取物對B1和B5的抑菌效果有所降低，但對B3的抑菌效果幾乎沒有影響，可見貴州綠僵菌提取物對B3較為敏感。當紫外光照時間為150 min時，3種細菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑依然為8.1、9.5、10.3 mm，說明貴州綠僵菌提取物幾乎不受紫外燈照時間的影響，提取物光穩(wěn)定性較強。

圖1光照對貴州綠僵菌提取物抗菌活性的影響
Fig.1 Effcets of illumination time on antibacterial activity of extracts ofM.guizhouense

2.2.2熱穩(wěn)定性分析

由圖2可知，隨著處理溫度的升高，貴州綠僵菌提取物產(chǎn)生的抑菌圈直徑減小，抑菌活性有所降低，對B5的抑菌效果幾乎沒有影響；當處理溫度為100 ℃時，抑菌圈直徑依然在7 mm以上，表明貴州綠僵菌提取物依然具有較好的抑菌活性，其抗熱能力較強。

圖2不同溫度處理對貴州綠僵菌提取物抗菌活性的影響
Fig.2 Effcets of different temperature on antibacterial activity of extracts ofM.guizhouense

2.2.3酸堿穩(wěn)定性分析

由圖3可知，隨著酸堿度的增加，抑菌圈直徑出現(xiàn)不規(guī)律的上下浮動趨勢，但均無明顯增幅或減幅；在較高的pH下，貴州綠僵菌提取物產(chǎn)生的抑菌圈直徑依然在7 mm以上，對3種細菌依然具有抗菌活性，表明具有一定的耐酸堿能力。

圖3酸堿度對貴州綠僵菌提取物抗菌活性的影響
Fig.3 Effcets of pH on antibacterial activity of extracts ofM.guizhouense

2.3 不同氮源培養(yǎng)基中貴州綠僵菌提取物抑菌活性比較

不同氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)后貴州綠僵菌提取物對B1、B3、B5抗菌結(jié)果見圖4，圖中數(shù)字1～11分別代表GSM1、GSY2、GST、GSP、GSS、GSY1、GSB、GSL、GSB1、GSM2、GSSY2培養(yǎng)基培養(yǎng)后提取物浸泡過的濾紙片，空白濾紙為陰性對照。從圖4可以看出，陰性對照濾紙片周圍長滿細菌，1～11號濾紙片周圍無細菌生長，形成了透明的抑菌圈，且不同培養(yǎng)條件下抑菌圈的大小及直徑不同?？梢?，不同氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)的貴州綠僵菌提取物的抑菌效果差異明顯。

貴州綠僵菌提取物產(chǎn)生的抑菌圈直徑越大，抑菌效果越好。由表1可以看出，添加不同氮源的液體培養(yǎng)基，經(jīng)其培養(yǎng)后，貴州綠僵菌培養(yǎng)液的提取物均能對B1、B3和B53種細菌產(chǎn)生大小不同的抑菌圈，表明這11種氮源均能使貴州綠僵菌代謝產(chǎn)生抑菌化合物。在提取物濃度均為50 mg/mL時，不同氮源培養(yǎng)的提取物對同種細菌處理所得的抑菌圈直徑為9.6～16.2 mm。其中，B3抑菌圈直徑為10.7～17.3 mm，B5抑菌圈直徑為10.71～15.2 mm，表明不同氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)的貴州綠僵菌提取液的抑菌能力差別明顯。從抑菌圈直徑大小看出，抑菌效果最好的培養(yǎng)基為GSP培養(yǎng)基，說明馬鈴薯能刺激貴州綠僵菌產(chǎn)生具有更高抑菌活性的化合物。

圖4不同氮源培養(yǎng)基對貴州綠僵菌提取物抑菌活性的影響
Fig.4 Effcets of different nitrogen source media on antibacterial activities of extract ofM.guizhouense

表1 不同氮源培養(yǎng)基對提取物抑菌活性的影響Table1 Effcets of different nitrogen sources on antibacterial activity of extracts

2.4 不同碳源培養(yǎng)基中貴州綠僵菌提取物抑菌活性比較

由表2可知，不同碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)的貴州綠僵菌提取液中均能產(chǎn)生抗菌化合物，對B1和B3，StaY2S培養(yǎng)基培養(yǎng)的提取物具有較好的活性，而ManY2S培養(yǎng)基對B5具有較高刺激貴州綠僵菌產(chǎn)生抑菌化合物的能力。同時，碳源比氮源對培養(yǎng)物的影響更大，能刺激貴州綠僵菌菌絲體產(chǎn)生更多的代謝產(chǎn)物。

2.5 接種量對貴州綠僵菌提取物抑菌效果的影響

貴州綠僵菌菌絲體在生長過程中，較低接種量有利于菌絲體生長，菌絲體體積更大。接種500 μL菌絲體懸濁液，菌絲體經(jīng)萃取后得到的提取物最多，為75.4 mg/100 mL。從表3可知，相同濃度的提取物下 (50 mg/mL)，不同接種量對貴州綠僵菌提取物的抑菌活性影響不大。

表2 不同碳源培養(yǎng)基對提取物抑菌活性的影響Table 2 Effcets of different carbon sources on antibacterial activity of extracts

表3 不同接種量對提取物抑菌活性的影響Table 3 Effcets of different inoculation amount on antibacterial activity of extracts

2.6 培養(yǎng)時間對貴州綠僵菌提取物抑菌效果的影響

由表4可知，貴州綠僵菌在液體培養(yǎng)5 d時，就可產(chǎn)生抑菌化合物。隨著培養(yǎng)時間的增加，菌絲體提取物的產(chǎn)量增加，到第10 d時，菌絲體提取物的量最多，為86.4 mg/mL，隨后產(chǎn)量降低。隨著培養(yǎng)時間的增加，菌絲體提取物抑菌活性逐漸增強。當培養(yǎng)25 d時，抑菌圈直徑分別達到12.5、13.0、12.5 mm，抗菌效果最好。

表4 不同培養(yǎng)時間對提取物抑菌活性的影響Table 4 Effcets of different incubation time on antibacterial activity of extracts

3 結(jié)論與討論

已有研究表明，綠僵菌屬發(fā)酵液能對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌 (Pseudomonasaeruginosa)、肺炎桿菌 (Klebsiellapneumoniae)、糞腸球菌 (Enterococcusfaecalis) 產(chǎn)生明顯的抑制作用。通過對13種常見致病細菌活性進行篩選，發(fā)現(xiàn)貴州綠僵菌菌絲體提取物對B1(MIC: 6.25 mg/mL)、B3(MIC: 1.56 mg/mL) 和B5(MIC: 6.25 mg/mL) 具有抑菌效果，而對B11、B13、B12等均沒有活性。通過對比貴州綠僵菌與其他已有研究的綠僵菌所抗細菌種類差異，說明貴州綠僵菌培養(yǎng)物可能產(chǎn)生新的抑菌化合物。從戴氏蟲草菌絲體中分離并鑒定出具有抑菌活性的化合物為煙曲霉酸[22-23]，Lee等[27]也從金龜子綠僵菌中分離得到煙曲霉酸及其新型衍生物。煙曲霉酸具有抗腫瘤、抗微生物活性，是一種三萜類抗菌素[28]。煙曲霉酸對農(nóng)桿菌 (Agrobaoteriumtumefaciens)、大腸桿菌、辣椒瘡痂病菌 (Xanthomonasvesicatoria)、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、幽門螺桿菌 (Helicobacterpylori)、溶壁微球菌 (Micrococcuslysodeikticus)、銅綠假單胞菌、藤黃八疊球菌、乳酸鏈球菌 (Streptococcuslactis) 均具有抑制作用[29-30]。采用專用顯色劑Godin試劑對貴州綠僵菌提取物進行薄層色譜檢識，發(fā)現(xiàn)具有抑菌活性的貴州綠僵菌菌絲體提取物中有大量萜類物質(zhì)，由此推斷貴州綠僵菌的抑菌化合物有可能為一種新的萜類化合物。

OSMAC通過改變培養(yǎng)條件，培養(yǎng)方法和添加酶抑制劑等手段，激活微生物中沉默的生物合成基因簇，從而獲得結(jié)構(gòu)新穎、活性高的新化合物[31]。OSMAC策略對微生物中大量代謝途徑的表達有促進作用，改變微生物發(fā)酵條件可促使其產(chǎn)生多種類型的化合物，在微生物次生代謝產(chǎn)物的研究中具有廣泛的適用性[32]。采用OSMAC策略，研究不同氮源、碳源、接種量及不同接種時間對貴州綠僵菌菌絲體產(chǎn)生抑菌化合物及抑菌效果的影響，結(jié)果表明不同碳源和氮源對貴州綠僵菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的抑菌活性影響明顯，在提取物濃度相同的情況下，抑菌效果有明顯差異，說明OSMAC策略確實刺激某些基因的表達，從而獲得多種具有抑菌活性的化合物。貴州綠僵菌最佳抑菌效果培養(yǎng)條件的研究，為后續(xù)大量培養(yǎng)獲得抑菌提取物及其分離鑒定奠定基礎。

致謝：感謝云南大學中草藥生物資源研究所云百草實驗室虞泓教授對試驗材料貴州綠僵菌的饋贈；感謝昆明市食品藥品檢驗所贈送的13種供試菌種。

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