吳海波 王櫻潼 葉維雁 劉惠民

(1. 西南林業(yè)大學國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224；2. 廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

磷在植物的生長和發(fā)育過程中具有非常重要的作用，植物所需的磷只能通過其根系進行吸收，土壤中存在的根際細菌被認為是有效的解磷微生物[1]。土壤里90%以上的磷都是難溶性磷，基本不能夠被植物吸收和利用，而化學磷肥的使用又無法很好地改善植物缺磷的現(xiàn)狀，且長期使用還會引起一系列的生態(tài)問題[2-3]。在生產實踐中，人們?yōu)榱颂岣咦魑锂a量，每年都要向土壤中施入大量的可溶性磷肥，因而造成土壤板結，地力下降，環(huán)境污染，農產品品質下降等[4]。隨著綠色環(huán)保理念的興起，微生物菌肥因其綠色、無毒害、高效等特點受到廣泛的研究和推廣，逐漸取代了化學肥料在農林生產中的地位[5]。番木瓜 (Caricapapaya) 屬番木瓜科 (Caricaceae) 番木瓜屬 (Carica)，是 “熱帶三大草本果樹” 之一。番木瓜本身營養(yǎng)成分豐富，在食用、藥用、保健等方面均具有重要價值，市場前景廣闊[6-7]。目前，微生物菌肥在許多作物上的應用已得到諸多研究，但在番木瓜上的應用卻鮮有研究。因此，開展番木瓜解磷細菌發(fā)酵條件優(yōu)化研究，對研制微生物肥料以提高番木瓜的產量和品質具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究以前期篩選出的番木瓜4株根際土壤解磷菌作為研究材料，在實驗室條件下探討它們各自的發(fā)酵條件及其最佳組合條件，以期為今后番木瓜專用微生物菌肥的研制和生產提供科學依據(jù)和理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1供試菌株

供試菌株來源于前期從番木瓜根際土壤中篩選分離出的4株解磷菌，存放于-80 ℃冰箱。其中2株為解無機磷菌，標記為23、77號菌株，另外2株為解有機磷菌，標記為50、59號菌株。

1.1.2培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌，并用于進行拮抗實驗；蒙金娜無機磷培養(yǎng)基用于培養(yǎng)解無機磷細菌；蒙金娜有機磷培養(yǎng)基用于培養(yǎng)解有機磷細菌。

1.1.3菌株活化與培養(yǎng)

將冷凍保存于-80 ℃下的菌株取出，在37 ℃的水浴環(huán)境下解凍，至凍存管內菌液全部融化。在超凈工作臺上，將解凍后的菌液接種到NA斜面培養(yǎng)基上進行劃線分離，然后置于37 ℃、無光條件下連續(xù)培養(yǎng)2～3 d，以獲得大量的菌株資源。刮取兩環(huán)斜面劃線培養(yǎng)好的菌種，接入裝有100 mL NA液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在37 ℃、160 r/min條件下連續(xù)培養(yǎng)1～2 d，以得到生長良好的菌株。

1.2 實驗方法

1.2.1菌株間拮抗實驗

分別將活化后的4株菌株在NA培養(yǎng)基上進行兩兩十字交叉劃線，在37 ℃條件下培養(yǎng)1～2 d。每隔12 h觀察細菌的生長情況，如2個菌株交叉處不能正常生長，則說明它們間存在拮抗作用；如2個菌株交叉處生長良好，說明這2個菌株間不存在拮抗作用[8]。

1.2.2菌株生長曲線及解磷能力測定實驗

分別吸取4菌株0.2 mL菌液接入含10 mL NA液體培養(yǎng)基的試管內，每個菌株接種16個試管 (直徑18 mm、長180 mm) 并做好標記，在37 ℃、160 r/min條件下進行培養(yǎng)。分別在第0、4、6、8、10、12、14、16、18、24、30、36、48、60、72、84 h時進行3次取樣，測定600 nm處不同培養(yǎng)時長菌液吸光值，繪制各菌株生長曲線，據(jù)此確定各菌株在發(fā)酵培養(yǎng)時的最佳接種時間[9-10]。菌株解磷能力采用鉬銻抗比色法進行測定。

1.2.3發(fā)酵條件優(yōu)化實驗

1) 單因素實驗。分別將菌株以4 mL (8%) 的接種量接種到裝有50 mL對應液體培養(yǎng)的100 mL錐形瓶中發(fā)酵培養(yǎng)，初始培養(yǎng)條件pH 7.0，溫度37 ℃，轉速160 r/min，時間5 d為其基礎發(fā)酵條件 (CK)，測定各菌株發(fā)酵后的解磷能力[11]。在其他基礎培養(yǎng)條件不變的情況下，分別以溫度、初始pH、搖床轉速、裝液量、接種量和發(fā)酵時間為單因素設置不同的實驗梯度 (見表1)，測定4株菌株的解磷能力。以上實驗均重復3次。

表1 單因素實驗設計Table 1 Single factor experiment design

2) 正交實驗。根據(jù)單因素實驗結果，對培養(yǎng)溫度、裝液量、搖床轉速和接種量4個發(fā)酵條件進行了優(yōu)化實驗，實驗采用正交實驗L9(34)，進行3次重復。發(fā)酵后測定各菌株的解磷能力。

2 結果與分析

2.1 菌株間的拮抗實驗

各組合菌株間拮抗實驗結果見表2。在對各菌株進行兩兩交叉劃線后，其十字劃線交叉處均能正常生長，表明各菌株間沒有明顯的拮抗作用。因此，本實驗中所用的各菌株材料間彼此不存在明顯的生物拮抗現(xiàn)象，可用于后續(xù)菌株混合發(fā)酵等相關生物學特性的研究。

表2 各菌株之間的拮抗作用Table 2 Antagonistic effects between each strain

注：“-” 表示菌株間無拮抗作用； “+” 表示同一種菌株間的拮抗實驗。

2.2 各菌株生長曲線分析

4株菌株的生長曲線如圖1所示，23、50和59號菌株生長調整期相對較短，發(fā)酵后約4 h進入對數(shù)生長期；而77號菌株生長調整期相對較長，前6 h都處于生長調整期，之后緩慢進入對數(shù)生長期。23號菌株在發(fā)酵第4～30 h為其對數(shù)生長期，此時細菌生長狀態(tài)以及作用功效都處于最佳狀態(tài)，因此該時間段可被選取作為研究菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的最佳接種時間；第30～48 h為其穩(wěn)定期，此時細菌的增殖數(shù)和死亡數(shù)達到動態(tài)平衡狀態(tài)，細菌的性狀開始有不穩(wěn)定的情況出現(xiàn)，有害物質開始產生；第48 h進入衰亡期，由于有害物質的產生以及培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的不斷消耗，細菌開始出現(xiàn)死亡。與23號菌株不同，77號菌株進入對數(shù)生長期較慢 (第6～36 h)，穩(wěn)定期持續(xù)時間為12 h (第36～48 h)，第48 h進入衰亡期。50號菌株的對數(shù)生長期為第4～24 h；穩(wěn)定期為第24～30 h，持續(xù)時間僅有6 h，是4株菌株中穩(wěn)定期時間最短的，可能是該菌株很可能對營養(yǎng)物質消耗較快，對生長環(huán)境要求較為苛刻；第30小時進入衰亡期。59號菌株對數(shù)生長期與50號菌株相同，穩(wěn)定期為第24～36 h，第36 h進入衰亡期。

綜上所述，雖然23號菌株和77號菌株、50號菌株和59號菌株分別為同種功能的解磷菌，但是它們均有其各自特定的生理特性，表現(xiàn)出不同的生長特征。在后續(xù)的實驗中，均選取每一個菌株進入對數(shù)生長期的起始時間進行取樣，以獲得最佳發(fā)酵效果。另外，4株菌株的對數(shù)生長期重疊在第6～24 h，因此該時間段可作為后期各功能菌株混合發(fā)酵的最佳取樣時間范圍。

圖14株解磷菌的生長曲線
Fig.1 Growth curves of 4 phosphate-solubilizing bacteria

2.3 不同培養(yǎng)條件對發(fā)酵的影響

2.3.1培養(yǎng)溫度對各菌株搖瓶發(fā)酵的影響

如圖2可知，培養(yǎng)溫度對4株菌株的影響趨勢一致，即在達到最佳培養(yǎng)溫度前，隨著溫度的升高解磷能力逐漸增強；在最佳培養(yǎng)溫度之后，隨著溫度的升高菌株的解磷能力逐漸減弱。23號菌株和77號菌株均在31 ℃時表現(xiàn)出最佳解磷能力，而50號菌株和59號菌株則在33 ℃時表現(xiàn)出最佳解磷能力，說明同種類型的菌對生長溫度有著相同的要求，可能具有相似的生理代謝過程。而不同類型的菌則表現(xiàn)出一定的差異性，77號菌株和50號菌株在不同的溫度梯度下均具有顯著性差異 (P< 0.05)，23號菌株和59號菌株在31～35 ℃間差異不顯著，在其他溫度差異顯著 (P< 0.05)。

不同小寫字母表示差異顯著，不同大寫字母表示差異極顯著。

圖2不同培養(yǎng)溫度對4株根際菌解磷能力的影響
Fig.2 Effects of different culture temperatures on the phosphate-solubilizing ability of 4 rhizobacterial strains

2.3.2初始pH對菌株搖瓶發(fā)酵的影響

由于搖瓶發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的pH值一直在不停變化，不方便測量，因此本實驗選用培養(yǎng)基的初始pH作為參數(shù)[12]，實驗結果見圖3。由圖3可以看出，初始pH對4株菌株解磷能力的影響變化趨勢一致，即在達到最佳初始pH前，隨著初始pH的增加解磷能力逐漸增強；在最佳初始pH之后，隨著初始pH的增加解磷能力逐漸減弱。由方差分析結果可知，4株菌株的最佳初始pH均為7.0，顯著高于初始pH 6.0和8.0 (P< 0.05)；除23號菌株外，其余3個菌株在初始pH 8.0時的解磷能力均極顯著高于初始pH 6.0的解磷能力 (P< 0.01)?？梢?，中性初始pH條件下解磷菌的解磷效果最好，初始pH過高或過低均會不同程度地影響菌株的生長和繁殖，從而降低菌株解磷效果。

不同小寫字母表示差異顯著，不同大寫字母表示差異極顯著。

圖3不同初始pH對4株根際菌解磷能力的影響
Fig.3 Effects of different initial pH on the phosphate-solubilizing ability of 4 rhizobacterial strains

2.3.3搖床轉速對菌株搖瓶發(fā)酵的影響

由圖4可以看出，4株菌株的解磷能力與轉速在未達最佳搖床轉速前呈正比關系，待達到最佳搖床轉速后菌株的解磷能力與搖床轉速呈反比。方差分析表明，23號菌株在搖床轉速為160 r/min時解無機磷的能力最強，并極顯著高于搖床轉速為120、140 r/min時的解磷能力 (P< 0.01)；77、50、59號菌株在搖床轉速達180 r/min時解磷能力達到峰值，其中77號菌株的解磷能力極顯著高于其他4個處理 (P< 0.01)；50號菌株的解磷能力顯著高于搖床轉速為120、140、200 r/min時的解磷能力 (P< 0.05)；59號菌株在所有搖床轉速下均未表現(xiàn)出顯著差異，說明搖床轉速對該菌株解磷能力影響較小。

不同小寫字母表示差異顯著，不同大寫字母表示差異極顯著。

圖4不同搖床轉速對4株根際菌解磷能力的影響
Fig.4 Effects of different shaker speeds on the phosphate-solubilizing ability of 4 rhizobacterial strains

2.3.4裝液量對菌株搖瓶發(fā)酵的影響

由圖5可知，4株菌株解磷能力的變化趨勢均隨著裝液量的增加而增強，待解磷能力達到最強后再隨著裝液量的增加而逐漸下降。其中，23、77、59號菌株在裝液量為60 mL時的解磷效果最好，而50號菌株在裝液量為50 mL時具有最佳解磷效果。方差分析結果表明，不同裝液量對4株解磷菌的解磷能力均產生了不同程度的影響，其中77、59號菌株在60 mL裝液量時的解磷能力極顯著高于其他處理 (P< 0.01)；23號菌株在60 mL裝液量時的解磷能力顯著高于裝液量為30和70 mL時的解磷能力 (P< 0.05)；50號菌株在50 mL裝液量時的解磷能力顯著高于裝液量為30、60和70 mL時的解磷能力 (P< 0.05)。

不同小寫字母表示差異顯著，不同大寫字母表示差異極顯著。

圖5不同裝液量對4株根際菌解磷能力的影響
Fig.5 Effects of different liquid volumes on the phosphate-solubilizing ability of 4 rhizobacterial strains

2.3.5接種量對菌株搖瓶發(fā)酵的影響

由圖6可知，4株菌株的解磷能力都是隨著接種量的增大而出現(xiàn)先增強至峰值，然后再減弱的趨勢。方差分析結果表明，77、59號菌株均在接種量為2 mL時解磷能力達到最佳，并極顯著高于其他處理 (P< 0.01)； 23、50號菌株在接種量為3 mL時解磷效果最好，其中23號菌株的解磷能力極顯著高于其他處理 (P< 0.01)，50號菌株的解磷能力顯著高于接種量為4和5 mL時的解磷能力 (P< 0.05)。

不同小寫字母表示差異顯著，不同大寫字母表示差異極顯著。

圖6不同接種量對4株根際菌解磷能力的影響
Fig.6 Effects of different inoculum density on the phosphate-solubilizing ability of 4 rhizobacterial strains

2.3.6培養(yǎng)時間對株菌搖瓶發(fā)酵的影響

由圖7可知，4株菌株的解磷能力均隨著培養(yǎng)時間的延長而增強，在發(fā)酵培養(yǎng)5 d時解磷能力達到最強，之后隨著培養(yǎng)時間的延長而開始下降。方差分析結果表明，不同培養(yǎng)時間對4株菌株的解磷能力均具有不同程度的影響，其中23號菌株在培養(yǎng)5 d時的解磷能力顯著高于培養(yǎng)第7 d時的解磷能力 (P< 0.05)；77號菌株在培養(yǎng)5 d時的解磷能力極顯著高于其他處理 (P< 0.01)；50號菌株在培養(yǎng)5 d時的解磷能力極顯著高于培養(yǎng)3、4 d時的解磷能力 (P< 0.01)；而59號菌株的解磷能力在所有處理間均未表現(xiàn)出顯著差異，說明在一定范圍培養(yǎng)時間對該菌株的解磷能力影響不大。另外，4株菌株在發(fā)酵5 d時生長處于穩(wěn)定期，此時菌株的代謝和作用能力都處于最佳狀態(tài)。在發(fā)酵時間未達5 d時，菌株仍處于幾何對數(shù)生長期，此時各菌體還沒有生長到最佳狀態(tài)，解磷能力亦未發(fā)揮到最好狀態(tài)；而在第5天后各菌株進入衰亡期，由于菌體死亡量增加導致菌株的解磷能力逐漸下降。

不同小寫字母表示差異顯著，不同大寫字母表示差異極顯著。

圖7不同發(fā)酵時間對4株根際菌解磷能力的影響
Fig.7 Effects of different incubation periods on the phosphate-solubilizing ability of 4 rhizobacteial strains

2.4 各個菌株最佳發(fā)酵條件組合

根據(jù)6個單因素的結果及分析，按照正交實驗L9(34) 對23和77號菌株、50和59號菌株的培養(yǎng)溫度、裝液量、搖床轉速和接種量4個發(fā)酵條件進行了優(yōu)化實驗，實驗結果見表3～4，方差分析結果見表5。

從表3、表4和表5可知，4個發(fā)酵條件對23號菌株解磷能力影響的主次順序為：D(接種量)>B(轉速)>A(培養(yǎng)溫度)>C(裝液量)，其中接種量影響達到極顯著 (P< 0.01)，培養(yǎng)溫度和轉速影響達到顯著 (P< 0.05)，而裝液量影響不顯著。23號菌株的最佳培養(yǎng)條件為A2B2C3D1，即培養(yǎng)溫度33 ℃、搖床轉速180 r/min、裝液量60 mL、接種量3 mL。

4個發(fā)酵條件對77號菌株解磷能力影響的主次順序為：A(培養(yǎng)溫度)>C(裝液量)>B(轉速)>D(接種量)，其中培養(yǎng)溫度和裝液量影響達到極顯著 (P< 0.01)，轉速影響達到顯著 (P< 0.05)，接種量影響不顯著 (P> 0.05)。77號菌株的最佳培養(yǎng)條件為A2B3C2D2，即培養(yǎng)溫度33 ℃、搖床轉速200 r/min、裝液量50 mL、接種量3 mL。

4個發(fā)酵條件對50號菌株解磷能力影響的主次順序為：A(培養(yǎng)溫度)>D(接種量)>C(裝液量)>B(轉速)，其中培養(yǎng)溫度和接種量影響達到極顯著 (P< 0.01)，轉速和裝液量影響不顯著 (P> 0.05)。50號菌株的最佳培養(yǎng)條件為A1B1C3D1，即培養(yǎng)溫度31 ℃、搖床轉速160 r/min、裝液量60 mL、接種量1 mL。

表3 23和77號菌株發(fā)酵條件的正交實驗結果Table 3 Orthogonal design and result for fermentation conditions of both strain 23 and strain 77

表4 50和59號菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的正交實驗結果Table 4 Orthogonal design and result for fermentation conditions of both strain 50 and strain 59

續(xù)表4

表5 正交實驗方差分析結果Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment

4個發(fā)酵條件對59號菌株解磷能力影響的主次順序為：A(培養(yǎng)溫度)>B(轉速)>C(裝液量)>D(接種量)，其中培養(yǎng)溫度和轉速影響達到顯著 (P< 0.05)，而裝液量和接種量影響不顯著。59號菌株的最佳培養(yǎng)條件為A1B1C1D3，即培養(yǎng)溫度31 ℃、搖床轉速160 r/min、裝液量50 mL、接種量4 mL。

3 結論與討論

目前，大部分細菌的培養(yǎng)常采用LB培養(yǎng)基[13]，但本實驗采用NA和LB兩種類型的培養(yǎng)基分別對解磷菌進行活化研究時，發(fā)現(xiàn)NA培養(yǎng)基比LB培養(yǎng)基更利于解磷菌的生長，因此后續(xù)所有實驗均采用NA培養(yǎng)基進行平板制作和種子液發(fā)酵培養(yǎng)。在拮抗實驗中，任意2個菌株間均不存在拮抗作用，說明4株解磷菌能夠在一起很好地生長，從生態(tài)意義上也反映出這些功能菌株生長在相同的植物根際土壤環(huán)境中，這與4株菌株從相同的根際土壤分離結果相一致。

為了擴大細菌的增殖并調整細菌生長的時期，同時在發(fā)酵培養(yǎng)時能接入活性好、功效強的菌株，對4株解磷菌進行了生長曲線的測定。結果發(fā)現(xiàn)4株菌株均在培養(yǎng)6～24 h后進入對數(shù)生長期，而一般實際操作中宜選取種子液對數(shù)生長期中后期進行取樣，因此該時段可作為后期各功能菌株混合發(fā)酵的最佳取樣時間范圍。

目前，微生物菌肥的使用已越來越廣泛，為了降低生產成本和增加產量，需要對菌肥生產和菌株培養(yǎng)的各個環(huán)節(jié)盡可能的進行優(yōu)化，前人已做大量研究完成了對不同功能菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化[14-15]?？紤]到實際生產中對解磷菌解磷能力影響較大的發(fā)酵條件，本研究主要選擇了初始pH、培養(yǎng)溫度、轉速、裝液量、接種量、培養(yǎng)時間等6個因素進行研究。在初始pH研究中，所有4個菌株的最佳初始pH值均為7.0，其次是初始pH為7.5，酸性初始pH則解磷能力相對較差，據(jù)此推測初始pH環(huán)境偏酸性將不利于菌株的生長，原因可能是細菌在發(fā)酵過程中會產生有機酸等代謝產物；而中性至略偏堿性的初始pH值菌株解磷能力較強，說明這些細菌很可能生長在中性至偏弱堿性的土壤環(huán)境中或至少在其根際部位土壤的pH值接近中性。在搖床轉速優(yōu)化研究中，搖床轉速的快慢影響著培養(yǎng)液和菌群的混合程度以及溶氧量，實驗結果得出當搖床轉速是160 r/min時，23號菌株的解無機磷能力最強，當轉速達180 r/min時，77、50、59號菌株氧的傳遞速率較快、溶氧量較大，此時的解磷能力最強，說明它們均需要氧氣來維持自身的各種生命代謝活動，當達到一定轉速時其溶氧量最適合菌株的生長，各種生命代謝活動也最為活躍。同樣地，裝液量的多少也影響著氧氣的溶解量，裝液量過高或者過低菌株的解磷能力都不強，據(jù)此結合搖床轉速的單因素結果推測這4株菌株屬于需氧型細菌。前期研究結果表明，對于需氧微生物溶氧量的過大或過小對菌株的代謝途徑和酶的活性會產生影響，本實驗尚不清楚溶氧量過大或過小對這4株菌株影響的是通過改變代謝途徑還是降低了酶的活性，相關生物學過程及實驗分析還有待進一步研究。針對接種量的研究，實驗結果得出4個菌株的解磷能力都呈先增強再減弱的趨勢，推測適當增加菌株的接種量有利于縮短微生物的生長周期，使得微生物能充分利用養(yǎng)分和空間，從而能夠更好地生長。但是接種量過多則使得培養(yǎng)基的養(yǎng)分消耗過快和空間受到限制，也不利于細菌的生長。在培養(yǎng)時間的研究中，4株菌株均在發(fā)酵培養(yǎng)5 d時具有最高解磷能力，時間過短4株PGPR還在對數(shù)生長期，此時代謝生長未達到最大，時間過長細菌的生長周期進入衰亡期，有害物質積累，菌體活性和功能作用降低，產生自溶現(xiàn)象。

綜合單因素實驗結果，本研究中所有菌株均在初始pH 7.0和發(fā)酵培養(yǎng)5 d時具有最佳的解磷效果，所以在正交實驗中僅考慮培養(yǎng)溫度、搖床轉速、裝液量和接種量4個發(fā)酵條件。正交優(yōu)化后的最優(yōu)組合發(fā)酵條件參數(shù)與單因素優(yōu)化時的最優(yōu)發(fā)酵條件參數(shù)存在一定程度的差異，考慮到選擇的4個發(fā)酵條件之間會存在交互影響，從而改變了之前單個變量實驗時的最優(yōu)條件值。培養(yǎng)溫度和搖床轉速正交實驗結果與單因素實驗結果相同，說明兩者不存在交互作用；而裝液量和接種量則表現(xiàn)出差異性，說明它們受到交互作用的影響。另外，不論是解有機磷菌還是解無機磷菌，它們的最佳發(fā)酵條件均存在不同程度的差異，說明雖然4株菌株生活在同一土壤生境中，但是每一個菌株均有其特定的最適生長條件。自然環(huán)境中正是由于不同類型的功能菌株存在于同一植物根際表面或根內，才使得植物能夠適應多變的自然環(huán)境，從某種程度上很可能也反映了這4株解磷菌具有一定的相互協(xié)調、互補的能力。

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