錢 偉， 王娟紅， 賀建忠， 陳宏偉， 鄭毛亮， 常衛(wèi)華

(1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300 ；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室， 新疆 阿拉爾 843300)

多浪羊具有常年發(fā)情的優(yōu)良特性，一年四季均可發(fā)情，受長、短日照規(guī)律的影響較小，而大部分品種綿羊為季節(jié)性發(fā)情，受日照規(guī)律的影響較大，一般只在夏秋季節(jié)發(fā)情。 在規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖趨勢下，最大限度挖掘家畜的繁殖潛力是經(jīng)濟效益的追求所在，而季節(jié)性發(fā)情明顯限制了羊繁殖潛能的發(fā)揮。 目前對綿羊常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情的分子遺傳機制還不是很清楚，只是對季節(jié)性發(fā)情的主要生理途徑有個大致了解。 無論是非細胞生物的病毒，還是具有細胞結(jié)構(gòu)的真核生物及原核生物，其遺傳物質(zhì)發(fā)揮作用的最終執(zhí)行者均為蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的功能與活性決定了生物體活動的所有方面[1]。 有報道在黃體期，大量蛋白如血漿銅藍蛋白，乳鐵蛋白，DMBT1 及PIGR 與免疫系統(tǒng)有關(guān)，CD9 和腓骨蛋白均與組織重構(gòu)有關(guān)，而且myosin 9 和纖維連接蛋白在發(fā)情期和黃體明顯不同[2-3]。 隨著蛋白質(zhì)提取技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，學(xué)者對蛋白質(zhì)作用機制及功能的認識逐漸加深。 在整個蛋白質(zhì)研究過程中，蛋白質(zhì)的正確提取和分離是最重要的一環(huán)，尤其是高質(zhì)量蛋白的提取。 機體中的蛋白質(zhì)通常具有種類繁多、性質(zhì)差異大等特性，即使屬于同一類蛋白，同一種組織，但不同生理期、提取方法、提取效果也可能大不相同，蛋白提取優(yōu)劣嚴重影響蛋白組學(xué)后續(xù)試驗，比如同位素標記相對和絕對定量試驗。 該技術(shù)在多浪羊常年發(fā)情功能蛋白的挖掘上具有非常重要的意義[4-6]。

試驗利用超聲破碎對多浪羊發(fā)情期、發(fā)情間期和妊娠期卵巢進行蛋白提取，通過質(zhì)量檢測比較多浪羊不同生理時期卵巢蛋白提取效果，對卵巢組織或細胞內(nèi)的蛋白組成、表達水平、修飾情況等進行系統(tǒng)分析，為多浪羊常年發(fā)情調(diào)控機理的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 取發(fā)情期、發(fā)情間期和妊娠期多浪羊(塔里木大學(xué)動物試驗站飼養(yǎng))屠宰后立即取出卵巢，并用PBS 沖洗(pH 值7.4)組織表面，之后迅速投入液氮進行快速冷凍，并帶回實驗室-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要藥品與試劑 尿素、硫脲、SDS、考馬斯亮藍G-250、β-巰基乙醇、瓊脂糖、丙烯酰胺、蛋白酶抑制劑混合物等，購自Sigma 公司；NH4HCO3、Bradford 試劑、BSA 和蛋白Marker，購自Amresco 公司；其余常規(guī)試劑，購自新疆寶信生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同時間卵巢組織蛋白提取 分別取發(fā)情期、發(fā)情間期和妊娠期多浪羊卵巢0.1 g，加0.4 mL的蛋白裂解液(8.0 mol/L 脲、50 mmol/L NH4HCO3、1 ×蛋白酶抑制劑)進行超聲破碎，設(shè)置為每次2 s，間隔10 s，共5 min，整個操作在冰上進行。 超聲破碎物在冰上放置20 min 后，10，000 r/mim(4 ℃)離心30 min，取上清轉(zhuǎn)入新管，然后將蛋白提取液分裝，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Bradford 蛋白定量和標準曲線的繪制 采用Bradford 法對蛋白進行定量[7-8]，先將已知含量的BSA 配成不同濃度的蛋白溶液，分別測定其顯色后的光吸收值(OD 值)，根據(jù)OD 值與蛋白濃度之間的線性關(guān)系，繪制出蛋白濃度標準曲線，然后測定待測蛋白溶液顯色后的OD 值，參照BSA 標準曲線計算待測蛋白濃度。 所有操作步驟均在室溫狀態(tài)下完成。

分別取BSA 8 μg、10 μg、12 μg、14 μg、16 μg、18 μg 配成不同濃度的蛋白溶液，并測定吸光值，如果相關(guān)性R2＜0.95，標準曲線不能用于計算，重新進行試驗。 根據(jù)計算配置蛋白溶液，總體積為20 μL；同時準備被檢樣本1.0 μL，與19 μL 水混合，加入檢測酶標板，每個樣本檢測2 個復(fù)孔。 每個復(fù)孔加入200 μL Bradford 工作液，輕微吸打混勻。避光，室溫靜止放置15 min。 用酶標儀檢測，檢測波長設(shè)定在595 nm。 根據(jù)標準曲線推導(dǎo)出檢測蛋白的總量，并計算相應(yīng)濃度。

1.3.3 SDS-PAGE 檢測蛋白完整性 選玻璃板光面，用擦鏡紙蘸無水乙醇擦凈殘留污漬，并放置板夾上方，制備約12%分離膠(超純水26 mL、30%丙烯酰胺(29∶1)32 mL、1.5 mol/L Tris -HCl 20 mL、10% SDS 0. 8 mL、 10% APS 0. 8 mL、 TEMED 0.04 mL)80 mL，約10 -15 min SDS - PAGE 膠凝固。 各取15 μg 蛋白質(zhì)樣品5∶1 (v/v)加入5 ×上樣緩沖液，沸水浴5 min，14 000 r/min 離心10 min取上清，進行12% SDS-PAGE 電泳。 電泳條件：恒流14 mA，電泳時間90 min。

電泳結(jié)束后取出PAGE 膠，超純水沖洗3 ～4次。 然后將沖洗干燥的PAGE 放入托盤用考馬斯亮藍進行染色，用封口膜封住托盤后置與水平搖床上；染色結(jié)束后，用超純水沖洗膠片3 次，然后進行脫色至膠片背景為無色。 質(zhì)檢判定標準如下：

A 類：質(zhì)檢合格，蛋白條帶清晰、完整、均一，蛋白無降解，蛋白總量可以滿足2 次或者2 次以上試驗(iTRAQ 試驗：蛋白總量≥400 μg，Label Free 試驗：蛋白總量≥120 μg)；

B 類：質(zhì)檢合格，蛋白條帶清晰、完整、均一，蛋白無降解，蛋白總量可滿足1 到2 次試驗(iTRAQ 試驗：400 μg ＞蛋白總量≥200 μg，Label Free 試驗：120 μg ＞蛋白總量≥60 μg)；

C 類：質(zhì)檢合格，蛋白條帶有一定程度彌散，或蛋白有一定程度降解，蛋白總量滿足至少一次的試驗要求(iTRAQ：200 μg ＞蛋白總量≥100 μg；Label Free 試驗：60 μg ＞蛋白總量≥40 μg)，結(jié)果有一定的試驗風(fēng)險，如需繼續(xù)試驗，需要客戶有風(fēng)險準備；

D 類：質(zhì)檢不合格，蛋白條帶清晰、完整、均一，蛋白無降解，但總量不滿足1 次試驗要求(iTRAQ：蛋白總量＜100 μg；Label Free：蛋白總量＜40 μg)，需要重新提供樣品。

1.3.4 凝膠掃描 PAGE 膠染色脫色后，用圖像掃描系統(tǒng)(Bio -Rad)對凝膠進行圖像掃描。 掃描模式為256 灰階透視掃描，分辨率為600 dpi。 掃描完的凝膠用保鮮膜包好編號后置于4 ℃冰箱中保存，對掃描圖像進行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線 該試驗用Bradford 方法對發(fā)情期、發(fā)情間期和妊娠期多浪羊卵巢全蛋白質(zhì)含量進行測定，1 mg/mL BSA 溶液作標準液制作標準曲線，標準曲線見圖1，y = 0. 033 5x + 1. 034 5； R2=0.964，由標準曲線公式可知，標準曲線相關(guān)系數(shù)為0.964，線性關(guān)系良好，可以用于多浪羊卵巢全蛋白質(zhì)量的測定。

2.2 多浪羊卵巢全蛋白提取定量及SDS - PAGE電泳檢測結(jié)果 根據(jù)標準曲線，對發(fā)情間期、發(fā)情期和妊娠期多浪羊卵巢全蛋白質(zhì)含量進行，定量結(jié)果見表1，其濃度均在8 -15 μg /μL 之間。

圖1 BSA 標準曲線

SDS-PAGE 電泳檢測結(jié)果見中插彩版圖2，從圖2 可看出，3 個時期，每個時期2 個重復(fù)，6 個樣品總蛋白在25 ～200 kDa 分子量范圍內(nèi)得到有效分離。 蛋白條帶清晰、完整，蛋白無降解。 其中60 kDa左右LLY-4 和LLY -5 與其他四例樣本在該位置的蛋白豐度有些微差異。 根據(jù)判定標準：蛋白條帶清晰、完整、均一，蛋白無降解，蛋白總量可以滿足2次或2 次以上試驗，質(zhì)檢合格，均為A 類，可以滿足后續(xù)iTRAQ 試驗。

表1 多浪羊不同時期卵巢蛋白含量定量

3 討論

綿羊卵巢結(jié)構(gòu)復(fù)雜，富含脂類及其他干擾物質(zhì)，到目前為止，尚未建立一種標準化綿羊卵巢全蛋白的提取方法[9]，而且試驗蛋白樣品制備的好壞被認為是蛋白質(zhì)樣品能否成功分離的關(guān)鍵步驟[10]，只有提取合格的高質(zhì)量蛋白才能為動物組織特殊生理功能蛋白的研究提供基礎(chǔ)，因此組織蛋白提取方法、提取過程的優(yōu)化或不同組織蛋白提取過程的建立仍是必須的。 Jia 等[11]以綿羊卵巢組織為研究對象，建立了卵巢蛋白雙向凝膠電泳(2 -DE)最佳體系，對卵巢蛋白提取與處理、樣品上樣量以及等點聚焦電壓、時間等條件做了優(yōu)化，為其他動物卵巢組織的處理及2 -DE 提供了參考。 2014年，賈建磊等[12]通過研究不同電導(dǎo)率的水對綿羊卵巢蛋白提取及雙向電泳的影響發(fā)現(xiàn)，超純水做溶劑效果最好，去離子水次之，蒸餾水和自來水不適合做溶劑進行綿羊卵巢蛋白質(zhì)組研究。 2015年，孟永海等[13]以大鼠肌肉組織為試驗材料，比較了三氯乙酸(TCA )/丙酮沉淀法、改良的TCA/丙酮沉淀法和試劑盒法對其組織蛋白提取效果，發(fā)現(xiàn)常規(guī)的TCA 丙酮沉淀法提取的蛋白條帶模糊，其他兩種方法的提取的蛋白條帶很清晰，蛋白沒有降解，無拖尾現(xiàn)象，建立并優(yōu)化了組織蛋白提取方法。

本試驗利用超聲破碎方法對多浪羊發(fā)情期、發(fā)情間期和妊娠期卵巢進行蛋白提取，通過質(zhì)量檢測比較多浪羊不同生理時期卵巢蛋白提取效果，發(fā)現(xiàn)3 個時期6 個樣品總蛋白在25 ～200 kDa 分子量范圍內(nèi)得到有效分離，而且蛋白條帶清晰、完整，蛋白無降解。 其中60 kDa 左右LLY-4 和LLY-5 與其他四例樣本在該位置的蛋白條帶豐度有些微差異，但差異不顯著。 根據(jù)判定標準：蛋白條帶清晰、完整、均一，蛋白無降解，蛋白總量≥400 μg，質(zhì)檢合格，均為A 類，可以滿足后續(xù)iTRAQ 試驗進行蛋白組學(xué)的研究。 該方法的試驗條件相對較低，操作簡單，不需要很多的儀器設(shè)備，相對其他方法比較便宜，廣泛性高，更適合于動物組織蛋白的大量提取，為相關(guān)的組織蛋白的提取方法提供實驗依據(jù)

綜上所述，本研究采用超聲破碎法提取純化了多浪羊不同生理時間卵巢全蛋白，質(zhì)量合格，滿足后續(xù)蛋白組學(xué)研究，對多浪羊重要繁殖調(diào)控細胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)組成、表達水平，以及蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系等進行系統(tǒng)的分析，揭示蛋白質(zhì)與多浪羊繁殖調(diào)控活動的內(nèi)在聯(lián)系和規(guī)律，為研究多浪羊常年發(fā)情的繁殖機理提供基礎(chǔ)。