田萬年， 薛書江， 賈立軍， 張守發(fā)

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院， 吉林 吉林 132101；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 吉林 延吉 133002)

牛的卵形巴貝斯蟲病(Babesia ovata)是由巴貝斯科巴貝斯屬的卵形巴貝斯蟲寄生于牛紅細(xì)胞內(nèi)所引起的寄生蟲病。 我國于1986 年在河南省盧氏縣牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)本病，隨后1994 年，在甘肅張家川回族自治縣牛體內(nèi)分離到卵形巴貝斯蟲[1]。 目前牛卵形巴貝斯蟲的診斷主要通過血液涂片，顯微鏡檢查為主。 PCR 方法是一種快速、敏感、特異的診斷方法，已應(yīng)用牛卵形巴貝斯蟲病的診斷。 Sivakumar等[2]根據(jù)AMA-1 基因建立了卵形巴貝斯蟲PCR 檢測方法。 黃國明等[3]根據(jù)卵形巴貝斯蟲CCTη 基因設(shè)計特異引物，建立了卵形巴貝斯蟲巢式PCR 診斷方法。 田萬年等[4-5]建立了卵形巴貝斯蟲熒光定量PCR 檢測方法，對延邊地區(qū)卵形巴貝斯蟲病進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查。 目前國內(nèi)外未見關(guān)于以上3 種方法比較的文獻(xiàn)，本試驗從敏感性和臨床樣本檢出率方面進(jìn)行對比，篩選出牛卵形巴貝斯蟲病的最佳檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 血液樣本采自吉林省琿春地區(qū)散養(yǎng)的延邊黃牛血樣86 份，無菌采取抗凝血，用PBS洗3 次。 存于-20 ℃?zhèn)溆谩?同時制作了血液涂片，甲醛固定保存，供染色鏡檢。 牛巴貝斯蟲標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA 由日本帶廣畜產(chǎn)大學(xué)玄學(xué)南教授惠贈，牛瑟氏泰勒蟲基因組DNA 由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存。

1.2 主要試劑 全血DNA 提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2 000 DNA Marker、SYBR Green I Master 等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。 熒光定量PCR 儀為Agilent 公司產(chǎn)品。 PCR 儀為Agilent 公司產(chǎn)品。

1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank 上登錄的牛卵形巴貝斯蟲18S rRNA 基因序列(AY081192)，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計了4 對特異引物(見表1)。 引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 試驗所用引物信息

1.4 牛卵形巴貝斯蟲DNA 標(biāo)準(zhǔn)模板的制備 按照全血基因組DNA 提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA，抽提的DNA 用50 μL TE 溶解， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR 反應(yīng)條件 普通PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。 巢式PCR 反應(yīng)條件：第1 次PCR：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。 第2 次PCR：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min；熒光定量PCR 反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃10 s，60 ℃15 s，72 ℃20 s，共40 個循環(huán)。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備 經(jīng)姬姆薩染色后顯微鏡鏡檢、PCR 檢測測序后確診為牛卵形巴貝斯蟲感染抗凝血，按照全血基因組DNA 提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA，應(yīng)用特異性引物(巢式PCR 外引物)進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物回收，與pMD-18T 載體連接后鑒定為陽性菌株送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.7 不同PCR 特異性試驗 以牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA 為對照樣本。分別應(yīng)用普通PCR、巢式PCR 和熒光定量PCR 進(jìn)行檢測，分析其特異性。

1.8 不同PCR 敏感性試驗 將重組陽性質(zhì)粒在1 ×107Copies/μL 基礎(chǔ)上進(jìn)行10 倍倍比稀釋，最小濃度為1×100Copes /μL。 進(jìn)行普通PCR、巢式PCR和熒光定量PCR 擴(kuò)增，比較3 種方法的靈敏度。

1.9 臨床樣本的檢測試驗 應(yīng)用普通PCR、巢式PCR 和熒光定量PCR 分別對采自吉林省琿春地區(qū)的86 份血液樣品進(jìn)行檢測，比較3 種PCR 方法的陽性檢出率。

2 結(jié)果

2.1 不同PCR 特異性試驗 特異性試驗結(jié)果顯示，僅牛卵形巴貝斯蟲DNA 樣本擴(kuò)增后出現(xiàn)特異性DNA 條帶，而牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲均未擴(kuò)增目的條帶(見圖1、圖2)。

圖1 巢式PCR(A)和普通PCR(B)特異性試驗結(jié)果

圖2 熒光定量PCR 特異性試驗結(jié)果

2.2 不同PCR 的靈敏度檢測結(jié)果 將質(zhì)粒DNA模板按10 倍倍比稀釋成1 ×107～1 ×100Copies/μL，巢式PCR 靈敏度最高，普通PCR 靈敏度最低，結(jié)果見圖3，圖4。

圖3 普通PCR(A)和巢式PCR(B)靈敏度檢測結(jié)果

圖4 熒光定量PCR 靈敏度檢測結(jié)果

2.3 不同PCR 臨床樣本檢測 分別應(yīng)用血涂片鏡檢、普通PCR、巢式PCR 和熒光定量PCR 對采自吉林省琿春地區(qū)86 份血液樣本進(jìn)行檢測(見表2)。結(jié)果顯示，熒光定量PCR 方法更為敏感。

表2 臨床樣本檢測結(jié)果

3 討論

目前，我國對牛卵形巴貝斯蟲病的診斷主要通過血液涂片鏡檢的常規(guī)診斷方法確診本病[6]。 卵形巴貝斯蟲傳播媒介為長角血蜱，由于長角血蜱也是瑟氏泰勒蟲的媒介蜱，因而卵形巴貝斯蟲和瑟氏泰勒蟲常混合感染[7]。 PCR 方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點是目前該病檢測的主要方法。 目前診斷該病PCR 方法主要有普通PCR、巢式PCR 和熒光定量PCR，以上3 種方法對牛卵形巴貝斯蟲檢測效果比較尚未見報道。

本試驗對比了3 種PCR 方法對卵形巴貝斯蟲的檢測靈敏度和臨床樣本檢出率方面進(jìn)行比較。結(jié)果表明，普通PCR 靈敏度最低，基于18S rRNA基因的巢式PCR 靈敏度是普通PCR 100 倍。 這與簡子健等[8]建立巢式PCR 檢測環(huán)形泰勒蟲比普通PCR 靈敏100 倍的結(jié)果相一致。 通過對86 份臨床樣本檢測表明，熒光定量PCR ＞巢式PCR ＞普通PCR。 普通PCR 在臨床檢測中可能出現(xiàn)一些漏檢，由于其檢測成本較低，適合樣本數(shù)量較大時臨床檢測。 熒光定量PCR 適合在普通PCR 檢測基礎(chǔ)上進(jìn)行定性分析。 而巢式PCR 操作較為繁瑣，易出現(xiàn)假陽性，更適合技術(shù)熟練者進(jìn)行臨床檢測。

綜上所述，普通PCR、巢式PCR 和熒光定量PCR 方法在牛卵形巴貝斯蟲檢測中都具有一定應(yīng)用價值，在臨床中根據(jù)檢測目的，選擇與之對應(yīng)的檢測方法，可作為血涂片鏡檢法的有效補(bǔ)充，為牛卵形巴貝斯蟲病的診斷提供參考依據(jù)。