王西西，陳 青，吳映彤，郭曉宇，李金祥

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 北京 100193；2.北京農(nóng)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方) 重點實驗室，北京102206；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，北京 100081）

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是一種核質(zhì)巨D(zhuǎn)NA病毒，在病毒分類中隸屬于DNA病毒目、非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬，為該科唯一成員，且是目前唯一已知的蟲媒DNA病毒[1]。ASFV病毒粒子具有雙層囊膜結(jié)構(gòu)，基因組為線性雙鏈DNA分子，不同毒株之間基因組大小存在一定差異，總體介于170～190 kb之間；ASFV基因組可編碼150多個開放閱讀框，成熟病毒粒子中含有50種以上結(jié)構(gòu)蛋白[2]。ASFV主要通過巨胞飲以及網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用感染宿主單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)[3,4]，根據(jù)毒力的不同可將其分為高致病性、中等毒力、低毒力以及感染無臨床癥狀毒株等。非洲豬瘟（african swine fever，ASF）臨床病例中以高致病性病毒感染最為常見，其發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%[5,6]。因此，OIE將ASF列為必須報告的動物疫病，我國也將其列為一類動物疫病。

20世紀(jì)中前期，ASF主要在非洲大陸豬群中傳播，1957年之后傳入歐洲多個國家，包括葡萄牙、西班牙、意大利和法國等，給上述國家的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。到20世紀(jì)90年代中期，除了仍在意大利的撒丁島流行，ASF已從歐洲消除[5,6]。2007年，ASF在高加索地區(qū)和俄羅斯暴發(fā)并持續(xù)流行，疫情延至東歐多國，再次突顯了ASF對全球養(yǎng)豬業(yè)的巨大威脅。由于ASFV強毒株基因組可編碼多種蛋白質(zhì)，用以干擾宿主的天然免疫系統(tǒng)，從而抑制和逃避宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)，為自身的增殖、擴散創(chuàng)造有利條件，使得ASF至今尚無有效疫苗用于防治，因此疫苗的研發(fā)對控制該病具有重大意義。針對ASFV疫苗的研究始于上世紀(jì)60年代，由于ASFV擁有龐大的基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的免疫逃逸機制，為疫苗研發(fā)工作帶來諸多困難。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、免疫學(xué)和疫苗學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，以及對病毒與宿主免疫系統(tǒng)互作機制的深入研究，ASF疫苗研制取得了較大進(jìn)展。本文對主要的ASF滅活疫苗、減毒活疫苗、病毒活載體疫苗、核酸疫苗以及基因工程亞單位疫苗等研究進(jìn)展進(jìn)行概述，以期為ASF疫苗開發(fā)提供參考。

1 滅活疫苗

傳統(tǒng)病毒疫苗可通過病毒滅活和病毒致弱兩種方法進(jìn)行制備。滅活疫苗通過物理或化學(xué)手段將病原滅活，使其失去感染能力，但保留其抗原性。迄今為止，采用多種傳統(tǒng)方法制備的ASF滅活疫苗均不能對強毒攻擊提供有效的免疫保護[7,8]，包括病毒接種肺泡巨噬細(xì)胞以及感染脾組織后勻漿制備的滅活疫苗。雖然用ASF滅活疫苗免疫后可產(chǎn)生高效價的抗體，但很難檢測到中和抗體的存在。Blome等[9]研究表明，即使用新型佐劑PolygenTM或Emulsigen(?)-D等與ASFV滅活抗原進(jìn)行配伍，免疫動物后能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生ASFV特異性抗體，但仍未能提高疫苗的免疫保護效力。這可能是由于產(chǎn)生的ASFV特異性抗體并不具有中和活性，提示細(xì)胞免疫在ASF疫苗免疫保護中起重要作用。此外，Gómez-Puertas等[10]研究人員也證實在細(xì)胞傳代過程中，低代次和高代次的ASFV毒株對中和抗體的敏感性存在差異。鑒于現(xiàn)有研究結(jié)果，采用傳統(tǒng)方法研制有效的ASF滅活疫苗困難很大。

2 減毒活疫苗

根據(jù)減毒活疫苗毒株來源不同，可將ASF減毒活疫苗毒株分為三類：傳代致弱毒株、天然致弱毒株和重組致弱毒株。減毒活疫苗能夠誘導(dǎo)強烈持久的免疫應(yīng)答，但生物安全是其使用的主要限制因素。采用分子生物學(xué)手段，可通過基因重組、靶向缺失以及一次性侵染技術(shù)來增強減毒活疫苗的安全性。

2.1 傳代致弱毒株 ASFV可經(jīng)過豬骨髓來源細(xì)胞、Vero和COS-1等細(xì)胞系傳代致弱。傳代過程中，ASFV致病力逐漸下降，同時病毒免疫原性和穩(wěn)定性也隨之下降。在西班牙和葡萄牙，使用傳代致弱毒株免疫動物后產(chǎn)生了災(zāi)難性的后果，免疫動物呈現(xiàn)出肺炎、流產(chǎn)和死亡等副作用，在田間多次感染和異源強毒株存在的條件下，許多免疫動物呈現(xiàn)ASF慢性感染臨床癥狀。因此，傳代致弱毒株的致病性導(dǎo)致此類疫苗的開發(fā)一度受阻。Krug等[11]利用分離株ASFV-G在Vero細(xì)胞中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，隨著傳代次數(shù)的增加，ASFV-G在Vero細(xì)胞中的復(fù)制能力增強，同時在豬原代巨噬細(xì)胞中的復(fù)制能力下降，病毒毒力逐漸衰減，在傳至第110代時完全喪失。家豬接種完全致弱的ASFV-G毒株后并未獲得相應(yīng)保護力，以抵抗母本病毒的攻擊[11]，表明傳代致弱的ASFV安全性較差且很難提供較好免疫保護。

2.2 天然致弱毒株 采用天然致弱ASFV毒株OURT88/3 或NH/P68免疫動物后，能誘導(dǎo)產(chǎn)生對同源強毒株的攻毒保護，依據(jù)實驗動物和攻毒毒株的不同，保護率介于66%～100%[12-15]。研究表明，病毒特異性抗體以及CD8+T細(xì)胞在免疫保護中均起重要作用，且OURT88/3毒株產(chǎn)生的免疫保護與病毒特異性IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞呈正相關(guān)性。采用NH/P68免疫后，豬對高毒力ASFV/L60感染抵抗力增強[13]。以O(shè)URT88/3免疫并用致病性O(shè)URT88/1毒株進(jìn)行加強免疫后，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對ASFV I型不同分離毒株的交叉保護[12]，表明研制具有交叉保護的ASFV疫苗是可能的。然而，天然致弱毒株免疫動物后可造成諸多副反應(yīng)，包括肺炎、流產(chǎn)、死亡等，免疫NH/P68毒株后25%～47%的豬呈現(xiàn)慢性感染[13]；免疫OURT88/3后可導(dǎo)致發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫脹等癥狀[15]?？傊?，天然致弱毒株導(dǎo)致的諸多副反應(yīng)以及存在散毒的可能性等生物安全隱患限制了其在實際生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用。

2.3 重組致弱毒株 采用分子生物學(xué)方法，敲除病毒功能基因、病毒毒力基因或者免疫抑制基因，可降低病毒毒力或增加機體對病毒的免疫應(yīng)答，研制比傳統(tǒng)弱毒疫苗安全性更好且效力更高的基因工程減毒活疫苗。研究表明，一些ASFV毒株在缺失單個或多個毒力基因/或免疫抑制基因后，如TK（K196R）、9GL（B119L）、CD2v（EP402R）、DP148R、NL（DP71L）、UK（DP96R）和多基因家族360和505（MGF 360/505），缺失毒株接種宿主毒力減弱且可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對同源母本毒株或異源毒株的特異性免疫保護（表1）[16-19]。ASFV編碼多種蛋白以干擾宿主免疫系統(tǒng)，已報道的病毒免疫逃逸相關(guān)基因包括A238L、A179L、A224L、 DP71L、MGF360/505、I329L、K205R、D96R、DP148R、A276R、D96R和EP153R等，其編碼蛋白抑制宿主細(xì)胞Ⅰ型干擾素和ISGs的產(chǎn)生，調(diào)控細(xì)胞凋亡、蛋白合成和自噬等多種信號通路[19-23]。由于這些蛋白質(zhì)可干擾宿主免疫應(yīng)答，從ASFV強毒株中缺失上述基因有助于增強宿主免疫應(yīng)答（表1）。

安全性和有效性是影響ASF 弱毒活疫苗田間應(yīng)用的重要因素，安全性和有效性與病毒毒株、免疫或感染劑量、病毒接種途徑以及接種動物密切相關(guān)。因此，致弱毒株保護性的強弱、是否有毒力殘留和是否導(dǎo)致持續(xù)感染是弱毒活毒株能否成為候選疫苗毒株的重要決定因素。因此，還需要進(jìn)一步研究以確定適合的缺失靶基因及其組合，以研制可誘導(dǎo)保護性免疫反應(yīng)且沒有相應(yīng)副作用的ASFV弱毒活疫苗。

表1 減毒活疫苗研究進(jìn)展Table 1 Progress towards the development of ASFV live attenuated vaccines

3 病毒活載體疫苗

已有研究表明，細(xì)胞免疫和體液免疫在抗ASFV感染中發(fā)揮作用[24-26]。有學(xué)者將ASFV保護性抗原重組入腺病毒或痘病毒載體，以期獲得更好的細(xì)胞免疫和CTL反應(yīng)。Lokhandwala等[27]將ASFV p32、p54、p72和pp62基因分別重組入人腺病毒Ad5載體中進(jìn)行“雞尾酒”式免疫，獲得了良好的抗原特異性CTL反應(yīng)；之后他們又將ASFV A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR 、B438L和K205RA104R共7個ASFV抗原基因，重組入復(fù)制缺陷型腺病毒載體，通過“雞尾酒”式混合免疫后能夠誘導(dǎo)強烈體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫應(yīng)答[28]。上述研究仍需通過攻毒保護試驗，進(jìn)一步驗證病毒活載體疫苗在ASF疫苗開發(fā)中的可行性。

4 核酸疫苗

ASF核酸疫苗的研究剛剛起步，通過將編碼病毒主要抗原的基因克隆入真核表達(dá)載體后，直接導(dǎo)入機體內(nèi)，在宿主細(xì)胞內(nèi)完成轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生抗原蛋白，從而同時激活體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。Argilaguet等將ASFV p72、p30和p54基因克隆入真核表達(dá)載體，制備ASF DNA疫苗，但該DNA疫苗免疫豬后并不能夠提供攻毒保護[29,30]。同組科研人員將ASFV p30和p54基因與豬白細(xì)胞抗原II的特異性抗體單鏈可變區(qū)基因在真核表達(dá)載體中融合表達(dá)；接種ASF DNA疫苗后，在沒有誘導(dǎo)產(chǎn)生可檢測水平ASFV抗體的情況下，能夠使部分動物獲得攻毒免疫保護，表明細(xì)胞免疫在ASFV疫苗的免疫中起重要作用[30]。最新研究表明，根據(jù)一個或兩個ASFV抗原構(gòu)建的DNA疫苗并不能誘導(dǎo)較高免疫保護，而免疫ASFV基因組DNA質(zhì)粒表達(dá)文庫能夠提供60%的保護力，說明有待于發(fā)掘更多保護性抗原，以提高核酸疫苗的保護水平[31]。

5 亞單位疫苗

ASF亞單位疫苗只包含特定的病毒抗原，需通過合適抗原傳遞系統(tǒng)免疫動物。鑒定可以引起強烈的免疫應(yīng)答的抗原及其表位，有助于開發(fā)有效的ASFV亞單位疫苗。研究表明，針對病毒p30蛋白的抗體在細(xì)胞水平抑制超過95%的ASFV內(nèi)化，p72和p54的抗體能夠抑制病毒吸附，表明這些蛋白在ASFV感染中發(fā)揮作用。用重組p30或p54蛋白免疫豬后可以誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，但不能提供針對急性ASF感染的保護[32]；相比之下，同時免疫 p30和p54蛋白或兩種蛋白的嵌合體可以提供部分保護[32,33]。用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的ASFV結(jié)構(gòu)蛋白p72、p30和p54等，以蛋白復(fù)合物作為抗原免疫動物后仍不能提供有效的免疫攻毒保護[32-34]，說明僅僅依靠上述抗原刺激產(chǎn)生的中和抗體很難獲得理想的免疫保護效果。在另一組研究中，Lopera-Madrid等[35]分別以人源293 (HEK) 細(xì)胞表達(dá)的ASFV B646L (p72)、E183L (p54)和O61R (p12)亞單位抗原，或者痘苗病毒載體疫苗進(jìn)行首免和加強免疫，獲得較好的體液免疫和細(xì)胞免疫水平。因此，需要研究鑒定更多的ASFV保護性抗原、開發(fā)新型免疫佐劑以及采用DNA首免蛋白質(zhì)加強免疫策略，以提高ASF基因工程亞單位疫苗的免疫效力。

6 展望

2017年初至今，俄羅斯境內(nèi)多個州發(fā)生ASF疫情，其中，伊爾庫茨克州、鄂木斯克州發(fā)生地點距離我國邊境較近，因此對于我國疫情防控而言，除做好風(fēng)險防范工作以外，研發(fā)安全有效ASF疫苗也迫在眉睫。過去的幾十年中，對ASF疫苗的研究雖取得了較大進(jìn)展，包括評估細(xì)胞傳代致弱、自然致弱、基因缺失等ASFV疫苗，但是所有努力都未能研制出可應(yīng)用于實際生產(chǎn)的疫苗。通過基因重組技術(shù)，獲得安全、高效ASFV減毒活疫苗仍是ASFV疫苗開發(fā)的首選策略。然而，仍有一些問題需要考慮，包括弱毒疫苗在體內(nèi)的安全性研究，以及鑒定并開發(fā)適合弱毒活疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系等[36]。研發(fā)可鑒別野毒感染和疫苗免疫的ASF亞單位疫苗、病毒活載體疫苗、核酸疫苗、以及復(fù)制缺陷型疫苗[37]也是研發(fā)ASFV疫苗的重要策略，尤其是在沒有疫病流行地區(qū)的使用。與減毒活疫苗相比，這些疫苗的生物安全性有所提高，但鑒定病毒保護性抗原，有效的遞送機制以及高效的免疫佐劑[38,39]都需要長期的研究和探索。

87 國外畜牧學(xué)-豬與禽 4-361 月刊 96.00 潘雪男 021-62209279 上海市閔行區(qū)北翟路2901號 201106 shzyq2005@126.com

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