曲昱蓉，詹 媛，仇旭升，丁 鏟

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

高遷移率族蛋白HMGB1（high mobility group box 1）是一種大小約為29 kDa的非組蛋白的核蛋白，在所有真核細(xì)胞中都表達(dá)并且在進(jìn)化中高度保守[1]。它的215個(gè)氨基酸殘基形成了兩個(gè)DNA結(jié)合區(qū)（A盒和B盒）以及帶負(fù)電的C末端。HMGB1蛋白在細(xì)胞核內(nèi)起到重要的作用，核內(nèi)的HMGB1蛋白無序列特異性的結(jié)合至DNA小溝中，引起DNA螺旋結(jié)構(gòu)的彎曲。這使其與DNA和各種因子包括p53、NF-κB、同源包含蛋白、重組激活基因1/2蛋白（RAG1/2）和類固醇激素受體之間形成物理性相互作用[2]。HMGB1蛋白可以由壞死細(xì)胞或損傷的細(xì)胞被動(dòng)釋放或者通過先天性免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌到細(xì)胞外[3]。目前已知HMGB1蛋白除了作為核蛋白，同樣也是損傷相關(guān)模式分子（DAMP），參與到內(nèi)毒素休克、血管損傷以及全身性炎癥反應(yīng)[4]。

本研究利用RT-PCR技術(shù)從CEF細(xì)胞中擴(kuò)增出雞HMGB1（chicken HMGB1，chHMGB1）基因，在0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)了chHMGB1重組蛋白，并對表達(dá)出的可溶性蛋白進(jìn)行純化。同時(shí)成功制備了鼠抗chHMGB1多克隆抗體。實(shí)驗(yàn)表明chHMGB1重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)特性，以此蛋白制備的多克隆抗體可以特異性檢測到禽源細(xì)胞內(nèi)的HMGB1蛋白，為進(jìn)一步研究chHMGB1蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮的生物學(xué)作用提供重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞 大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）購買于天根生化科技有限公司；原核表達(dá)載體pET-28a（+）和本研究所用細(xì)胞均由上海獸醫(yī)研究所禽病研究室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；SPF級BALB/c小鼠購自斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 主要試劑EcoRI 和XhoI限制性內(nèi)切酶、高保真酶PrimeSTAR購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技有限公司；HRP標(biāo)記二抗、FITC標(biāo)記二抗和封片劑購自Sigma公司；蛋白Marker購自Thermo公司；細(xì)胞核染色液購自碧云天生物技術(shù)研究所；增強(qiáng)型ECL發(fā)光試劑盒購自圣爾生物公司；DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清FBS購自Biological Industries公司；Opti-MEM培養(yǎng)基、無EDTA胰酶購自Gbico公司；0.45 μm、0.22 μm直徑濾器購自Millipore公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.4 方法

1.4.1 CEF細(xì)胞制備 取9～10日齡SPF雞胚無菌去除肌肉和內(nèi)臟，用DMEM培養(yǎng)基清洗后剪碎，加入無EDTA的胰酶在37℃消化20～30 min。加入胎牛血清終止消化，1500×g離心15 min后棄去上清。用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基吹懸沉淀，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞瓶內(nèi)，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.2 細(xì)胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 待6孔板內(nèi)CEF細(xì)胞/HeLa細(xì)胞長成單層后，每孔加入1 mL Trizol吹下細(xì)胞后收集到1.5 mL EP管內(nèi)，加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min后，10 000×g離心10 min。離心后取上清至新的1.5 mL EP管內(nèi)，加入1 μL糖原，并按照總體積1∶1加入異丙醇，混勻后-40℃放置1 h。10 000×g離心10 min后棄去上清，用70%乙醇洗滌兩次后風(fēng)干，最后用20 μL DEPC水70℃溶解5 min。取2 μg RNA作為模板，以18T為引物，按照Promega公司的Reverse Transcription System方法進(jìn)行，最終獲得cDNA。

1.4.3 chHMGB1基因和huHMGB1基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank上公布的雞HMGB1基因和人HMGB1（human HMGB1，huHMGB1）基因的CDS序列設(shè)計(jì)并合成2對引物（chHM-F/chHM-R、huHM-F/huHM-R），其序列見表1。分別以CEF細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的cDNA為模板，采用PrimeSTAT高保真酶進(jìn)行chHMGB1/huHMGB1基因的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，按照Axygen公司膠回收試劑盒操作說明書進(jìn)行膠回收純化目的條帶。將回收的目的條帶與pZeroblunt載體連接后，轉(zhuǎn)化并提取陽性質(zhì)粒送生工生物工程有限公司測序。擴(kuò)增引物見表1。

表1 本研究引物Table 1 Primers in this study

1.4.4 原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 為構(gòu)建chHMGB1的原核表達(dá)質(zhì)粒、真核表達(dá)質(zhì)粒和huHMGB1的真核表達(dá)質(zhì)粒，分別合成3對引物（ch28a-F/ch28a-R、chFLAG-F/chFLAG-K、huFLAG-F/huFLAG-R），引物見表1。

將測序陽性的質(zhì)粒進(jìn)行50倍稀釋作為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)酶切后，與載體pET-28a（+）和p3×FLAG-CMV-14，4℃連接過夜、轉(zhuǎn)化，并分別涂布于卡那抗性和氨芐抗性的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)，次日挑取單菌落進(jìn)行鑒定培養(yǎng)，菌液PCR初步鑒定正確的質(zhì)粒送測序。將測序鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pET-28achHMGB1、FLAG-chHMGB1和FLAG-huHMGB1。1.4.5 重組雞HMGB1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將pET-28a-chHMGB1重組質(zhì)粒和pET-28a空載體分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21（DE3），挑取單菌落接種到5 mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，按1∶100的比例接種于含有卡那霉素的2YT培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3 h時(shí)，加入0.5 mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。10 800×g離心30 s收集上述大腸桿菌菌液，用PBS 緩沖液重懸菌液后超聲裂解，10 000×g離心10 min 分離上清和沉淀。以未加IPTG 誘導(dǎo)的pET-28a-chHMGB1和pET-28a作為對照，進(jìn)行 SDS-PAGE，分析蛋白在上清和沉淀中的表達(dá)情況。

1.4.6 重組雞HMGB1融合蛋白的純化 通過實(shí)驗(yàn)證明chHMGB1原核表達(dá)的融合蛋白28a-chHMGB1以可溶形式存在，離心收集菌液，與1×Ni-NAT Bind Buffer（300 mmol/L NaCl、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液、10 mmol/L咪唑、1 mmol/L PMSF，pH=8.0）充分混勻后，冰水浴超聲裂解至菌液清亮，離心收集上清，在上清中加入Ni-NAT His·Bind Resin，4℃搖晃4 h后，將混合液裝入純化柱，用1×Ni-NAT Wash Buffer（300 mmol/L NaCl、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液、20 mmol/L咪唑）洗滌，用1×Ni-NAT Elute Buffer（300 mmol/L NaCl、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液、250 mmol/L咪唑）洗脫，采用SDS-PAGE分析蛋白洗脫情況。

1.4.7 多抗血清的制備 取純化的chHMGB1蛋白50 μg與相同體積弗式完全佐劑乳化后，腹部皮下多點(diǎn)注射Balb/c小鼠。首免后第14 d、28 d、42 d分別取50 μg chHMGB1蛋白與等體積弗氏不完全佐劑乳化后，對小鼠進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫，最后1次免疫后第14 d小鼠眼球采血，血樣37℃放置1 h，4℃放置2 h后，4℃、2000×g離心10 min所得上清即為多克隆抗體。

1.4.8 多克隆抗體鑒定

1.4.8.1 chHMGB1多克隆抗體ELISA效價(jià)檢測 采用間接ELISA法檢測多克隆抗體效價(jià)，將純化的融合蛋白chHMGB1用CBS稀釋至5 μg/mL，每孔加入100 μL，4℃包被過夜。PBST洗滌3次后用含5%脫脂乳的PBST，4℃封閉過夜。PBST洗滌3次后，加入用PBST連續(xù)倍比稀釋的多克隆抗體血清和陰性血清，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次后每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，洗滌后每孔加入100 μL四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液，37℃顯色10 min，加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。通過酶標(biāo)儀檢測OD450值。若陽性與陰性的比值大于2.0，則視為陽性，否則為陰性。

1.4.8.2 chHMGB1多克隆抗體Western blot效價(jià)檢測 在6孔板中分別接種DF1細(xì)胞和HeLa細(xì)胞，待其長至70%時(shí)轉(zhuǎn)染FLAG-14、FLAG-chHMGB1和FLAG-huHMGB1質(zhì)粒，待轉(zhuǎn)染48 h后用IP細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，將已充分裂解的細(xì)胞樣品經(jīng)10 000×g離心10 min后，取上清加入5×蛋白上樣緩沖液并煮沸10 min，以制備Western blot實(shí)驗(yàn)所需樣品。將chHMGB1多克隆抗體和FLAG抗體（陽性對照）以適當(dāng)比例稀釋后作為一抗，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.4.8.3 chHMGB1多克隆抗體熒光效價(jià)檢測 將DF1細(xì)胞接種于孔底置有蓋玻片的6孔細(xì)胞板內(nèi)培養(yǎng)，將細(xì)胞生長至單層后棄去培養(yǎng)基，以4%的多聚甲醛室溫固定20～30 min。PBS洗3次，加入0.5%TritonX-100室溫透化10 min。PBS洗3次，使用3%BSA 37℃封閉30 min。以500倍稀釋的chHMGB1多克隆抗體作為一抗，以免疫前陰性血清作為陰性對照，37℃孵育1 h，PBS洗3次；以1∶500倍稀釋FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，37℃避光孵育30 min，PBS洗3次；最后以1∶500稀釋DAPI染核，37℃孵育5 min，PBS洗3次。將蓋玻片取出固定于載玻片上，通過熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.4.8.4 chHMGB1多克隆抗體特異性分析 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪滿-CEF細(xì)胞、-DF1細(xì)胞、-HeLa細(xì)胞、-HEK293細(xì)胞、-MARC-145細(xì)胞、-Vero細(xì)胞、-MEF細(xì)胞、-RAW246.7細(xì)胞、-PAM細(xì)胞和-PK-15細(xì)胞，待其分別長滿時(shí)棄掉上清，用預(yù)冷的PBS洗滌2次后，每孔加入100 μL IP細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，將已裂解的細(xì)胞樣品經(jīng)10 000×g離心10 min后，取上清加入5×蛋白上樣緩沖液并煮沸10 min，以制備Western blot實(shí)驗(yàn)所需樣品。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，以制備的chHMGB1多克隆抗體作為一抗（1∶1000稀釋），HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶8000稀釋）作為二抗進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 chHMGB1基因擴(kuò)增及原核表達(dá)載體構(gòu)建 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析與預(yù)期大小一致，約648 bp（圖1）。重組質(zhì)粒pET-28a-chHMGB1雙酶切及PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，與預(yù)期的目的片段大小相符，且測序完全正確，表明pET-28a-chHMGB1重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 chHMGB1基因PCR擴(kuò)增Fig.1 Ampli fi cation of chHMGB1 gene

2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析 SDS-PAGE分析結(jié)果顯示pET-28a-chHMGB1誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白chHMGB1，約在27 kDa處有一條特異性條帶，而空載體對照質(zhì)粒表達(dá)的蛋白中沒有此條帶，且融合蛋白主要存在于上清中。該結(jié)果說明在大腸桿菌BL21（DE3）中成功誘導(dǎo)了pET-28a-chHMGB1蛋白的表達(dá)，并且主要以可溶性蛋白形式表達(dá)（圖2）。

圖2 pET-28a-chHMGB1重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant pET-28achHMGB1 protein

2.3 chHMGB1多克隆抗體ELISA效價(jià)檢測結(jié)果 以純化的融合蛋白chHMGB1為包被抗原，以未免疫小鼠血清作為陰性對照，測定雞HMGB1多克隆抗體效價(jià)。多克隆抗體和陰性血清按照100×21～100×211（204 800）連續(xù)稀釋，結(jié)果顯示當(dāng)多克隆抗體稀釋100×211倍時(shí)，OD陽性/OD陰性＞2.0，說明該多克隆抗體ELISA效價(jià)大于1∶204 800。

2.4 chHMGB1多克隆抗體Western blot效價(jià)檢測結(jié)果 以多克隆抗體作為一抗，檢測轉(zhuǎn)染FLAG-14、FLAG-chHMGB1和FLAG-huHMGB1質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞樣品，以針對FLAG標(biāo)簽的抗體作為陽性對照。結(jié)果顯示，制備的多克隆抗體與雞HMGB1蛋白具有良好的反應(yīng)性，并且條帶大小與陽性對照（FLAG抗體）一致（圖3），說明該多克隆抗體能夠特異性地識(shí)別雞HMGB1蛋白，且Western blot效價(jià)為1∶1000。

圖3 pET-28a-chHMGB1蛋白多克隆抗體Western blot檢測Fig.3 Western blot analysis of pET-28a-chHMGB1 PcAb

2.5 針對融合蛋白chHMGB1的多克隆抗體熒光效價(jià)檢測 以多克隆抗體作為一抗與DF1細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測，結(jié)果顯示，多克隆抗體可以檢測到DF1細(xì)胞核內(nèi)HMGB1蛋白的綠色熒光與DAPI藍(lán)色細(xì)胞核染料染色部位重合，而陰性血清對照組細(xì)胞核部位卻沒有綠色熒光（圖4），抗體IFA效價(jià)可達(dá)1∶500。

圖4 chHMGB1多克隆抗體間接免疫熒光效價(jià)檢測Fig.4 IFA of pET-28a-chHMGB1 PcAb

2.6 chHMGB1多克隆抗體特異性檢測 取雞源的CEF細(xì)胞和DF1細(xì)胞、人源的HeLa細(xì)胞和293細(xì)胞、猴源的Marc-145細(xì)胞和Vero細(xì)胞、鼠源的MEF細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞、豬源的PAM細(xì)胞和PK-15細(xì)胞樣品，以針對chHMGB1蛋白的多克隆抗體作為一抗，進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示，該多克隆抗體僅能檢測到禽源細(xì)胞中27 kDa大小的chHMGB1蛋白，而不與人源、猴源、鼠源以及豬源細(xì)胞中HMGB1蛋白反應(yīng)，具有良好的細(xì)胞特異性（圖5）。

3 討論

圖5 chHMGB1多克隆抗體細(xì)胞特異性鑒定Fig.5 The cell speci fi ty of the chHMGB1 PcAb

抗體是一種特異性的檢測工具，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及生物學(xué)領(lǐng)域。HMGB1 除了可以作為一種核蛋白，也可以作為一種炎癥因子，參與調(diào)節(jié)病毒感染、損傷和炎癥等[2,5,6]。盡管有針對人或小鼠HMGB1的各種單克隆或多克隆抗體且與其他物種如猴、大鼠和狗具有交叉反應(yīng)性，但沒有特異性識(shí)別雞HMGB1的抗體。在本研究中，我們將構(gòu)建的pET-28a-chHMGB1原核表達(dá)載進(jìn)行原核表達(dá)，并通過Ni-NTA柱純化原核表達(dá)chHMGB1蛋白。將純化后的重組chHMGB1蛋白免疫小鼠，以制備多克隆抗體。該多克隆抗體同時(shí)具有ELISA、Western blot和IFA效價(jià)。該抗體不僅可以與重組chHMGB1蛋白反應(yīng)，還能檢測到細(xì)胞內(nèi)源性chHMGB1蛋白。Western blot結(jié)果顯示該多克隆抗體種屬特異性強(qiáng)，僅與家禽細(xì)胞的HMGB1蛋白反應(yīng)，而不與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的HMGB1反應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所制備的針對chHMGB1蛋白的多克隆抗體可以被用于研究雞HMGB1蛋白的功能和其在細(xì)胞信號通路里所發(fā)揮的作用。

大量證據(jù)表明，HMGB1在多種病毒感染性疾病中發(fā)揮潛在的致病作用。丙型肝炎病毒HCV感染時(shí)，可以觀察到細(xì)胞核內(nèi)的HMGB1蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，繼而又分泌至細(xì)胞外環(huán)境，而分泌至上清中的HMGB1蛋白又可以阻斷HCV的繼續(xù)感染[7]。HMGB1蛋白可以通過SARS病毒感染介導(dǎo)的細(xì)胞溶解而被動(dòng)釋放。一旦被釋放，細(xì)胞外的HMGB1會(huì)刺激產(chǎn)生有害的肺部炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致呼吸衰竭和死亡。但是，目前對于HMGB1蛋白和禽源病毒之間的關(guān)系還未有明確的結(jié)論。多種禽源性病毒如禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）等天然宿主細(xì)胞都為禽源細(xì)胞，而本研究制備的特異性針對雞HMGB1蛋白的抗體未來可以用于研究雞HMGB1蛋白是否參與到禽源性病毒發(fā)病機(jī)制。

除了禽流感病毒、新城疫病毒外一些其他病毒也都已被證明可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，且對全球養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅[8,9]。考慮到HMGB1蛋白與各種炎性疾病相關(guān)，并且釋放至細(xì)胞外環(huán)境中的HMGB1蛋白具有細(xì)胞因子樣功能，針對雞HMGB1的抗體可在未來用于確定HMGB1和禽源性病毒誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)之間的關(guān)系。禽類細(xì)胞在病毒感染后，原本位于細(xì)胞核的HMGB1遷移至胞質(zhì)區(qū)域和進(jìn)一步的釋放，可以通過使用特異性抗體進(jìn)行Western blot和IFA實(shí)驗(yàn)檢測。為探索HMGB1蛋白在禽病病毒復(fù)制和病毒感染激活NF-κB信號通路以及隨后的炎性因子表達(dá)中發(fā)揮的作用，通過采用特異性siRNA敲除內(nèi)源性HMGB1蛋白或使用該抗體阻斷細(xì)胞外HMGB1蛋白進(jìn)行研究。而這些實(shí)驗(yàn)研究將對了解禽流感病毒、新城疫病毒或其他禽類病毒如何誘導(dǎo)過度的炎癥反應(yīng)提供新的見解，為進(jìn)一步研究雞HMGB1蛋白在禽源性病毒發(fā)病機(jī)制中的作用以及為找到新的潛在治療靶點(diǎn)提供重要的生物試劑。

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