劉 騰，董丹丹，張 莉，朱 杰，繆秋紅，劉光清

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

傳代細胞系是開展動物病毒應用和基礎研究的重要平臺，然而有許多動物病毒缺乏能支持其穩(wěn)定增殖的本源宿主細胞系，例如小反芻獸疫病毒和兔瘟病毒，嚴重阻礙了這些病毒的分子生物學研究和疫苗研制工作。而某些原代細胞有限的傳代次數(shù)使得研究工作進展緩慢，因此原代細胞永生化技術(shù)應時而生。

細胞永生化方法有很多，主要有病毒感染法及端粒酶法。有研究表明，利用病毒感染或者重要基因片段轉(zhuǎn)染靶細胞以延長細胞壽命，或是使細胞永生化的方法所獲得的永生化細胞是有限的永生化并且存在核型不穩(wěn)定性，貼壁性降低，失去部分原代細胞特性、潛在誘發(fā)腫瘤危險等缺點[1-5]。其作用機制是因為其表達產(chǎn)物與轉(zhuǎn)錄因子P53或者PRb相互作用，使P53或PRb狀態(tài)發(fā)生變化，最終實現(xiàn)有限的永生化。如大T抗原通過其一級結(jié)構(gòu)101～108位點的氨基酸所形成的獨特的空間結(jié)構(gòu)位點與PRb-E2F復合物結(jié)合，使得E2F從PRb-E2F復合體上解離下來，從而激活下游信號通路使細胞永生化[6]。而利用端粒酶建立的永生化細胞系除了可以維持正常細胞的生理特性外，這些細胞還具有更快的生長速度及同原代細胞相同的核型，單層抑制生長等特點[7-10]。

因此，本研究旨在利用含有hTERT基因的慢病毒表達系統(tǒng)建立過表達hTERT基因的綿羊肺成纖維穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，為將來開展本源病毒分子致病機制及疫苗的研制工作提供有效的生物材料。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 pBabe-neo-hTERT質(zhì)粒、慢病毒表達載體pLOV-GFP-3Flag、包膜蛋白質(zhì)粒psPAX2、包裝質(zhì)粒pMD2.G、293T細胞和原代綿羊肺成纖維細胞均由本實驗室保存；Infusion連接酶購自全式金生物公司；NotI等限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；基因組提取試劑盒和Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒購自生物工程大連有限公司；DMEM培養(yǎng)基、MEM 培養(yǎng)基、1×PBS購自Hyclone 公司；胎牛血清購自Gibco公司；磷酸鈣鈣轉(zhuǎn)染試劑由本實驗室保存；CaCl2和 HEPES購自Sigma 公司；嘌呤霉素（Puromycin）購自Sigma 公司；HRP 標記的山羊抗鼠 IgG購自Santa Cruz 公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自QIAGENE公司；hTERT多克隆抗體購自abcam公司；上下游引物及DNA測序均由上海華津生物有限公司完成。

1.2 重組慢病毒載體（pLOV-puro-hTERT）的構(gòu)建 根據(jù)pBabe-neo-hTERT模板質(zhì)粒序列信息及NCBI（NM_198253.2）hTERT基因cDNA序列設計1對引物。InFu-hTERT-NotI (+)：5'- GCTCTAG ATAACTGAGCGGCCGCCATGCCGCGCGCTC CC-3'；InFu-hTERT-NotI(-)：5'- CCCTCGAC GCCTAGGGGCGGCCGCTCAGTCCAGGATGGT CTTGAA-3'。在上下游引物中均添加了NotI酶切位點（下劃線）及保護堿基。hTERT基因 PCR擴增反應程序：95℃預變性5 min；94℃變性1 min，60℃退火45 s，72℃延伸3 min 30 s，12℃ 終止反應。PCR擴增片段大小為3400 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)過膠回收純化后與pLOV-GFP-3Flag慢病毒載體利用NotI酶切，膠回收后，通過In fusion技術(shù)進行連接，構(gòu)建 pLOV-puro-hTERT重組質(zhì)粒，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定為陽性，然后送上海華津生物技術(shù)有限公司測序，確定插入基因正確。

1.3 制備重組慢病毒 轉(zhuǎn)染前1 d，將 293T 細胞飼養(yǎng)于細胞培養(yǎng)皿中，過夜培養(yǎng)，待細胞密度大約為 50%時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前 1 h更換新鮮無血清培養(yǎng)基；制備DNA-CaCl2復合物：將psPAX2（10 μg）、pMD2.G（15 μg）與pLOV-purohTERT（25 μg）/ pLOV-GFP-3Flag（25 μg）分別加至相應裝有66 μL 2.5 mol/L CaCl2溶液的2 mL離心管中，然后用無菌水將體積補至660 μL，充分混勻，室溫靜置3 min；取660 μL加熱至 37℃的2×HBS 緩沖液（pH7.01）（由140 mmol/L NaCl、1.5 mmol/L Na2HPO4·2H2O、50 mmol/L HEPES緩沖溶液組成），迅速滴加至DNA-CaCl2混合液中，并立即吹打充分混勻，室溫孵育10 min；將制備好的轉(zhuǎn)染液均勻滴加至293T細胞培養(yǎng)基表面，并在顯微鏡下觀察是否形成細小顆粒；轉(zhuǎn)染 16 h 后，用新鮮的含有5%FBS的完全培養(yǎng)基更換含轉(zhuǎn)染顆粒的培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染24 h和48 h后，分別收集含慢病毒顆粒的培養(yǎng)上清液，0.45 μm濾器過濾后分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 原代綿羊肺成纖維細胞的分離和培養(yǎng) 三月齡綿羊麻醉后處死，用75%乙醇消毒皮膚，取出肺組織，剪去血管等組織，用含有100 U/mL青鏈霉素的FBS反復沖洗肺組織，去除血污和組織碎片，用眼科剪將肺組織剪成約1 mm3大小的組織塊后置于三角錐形瓶中，加入適量胰酶在37℃水浴鍋中消化5～10 min，然后加入1 mL FBS終止消化，接著用8～10紗布過濾至離心管中，300×g離心5 min，棄去上清。用含10%FBS的DMEM重懸細胞，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當原代綿羊肺成纖維細胞生長至80%～90%匯合度時，用PBS清洗細胞，加入適量胰酶消化45 s～1 min，當細胞開始變圓，細胞間隙變寬時棄去胰酶，加入適量完全培養(yǎng)基輕輕吹打混勻后，按照1∶2的比例傳代培養(yǎng)。

1.5 最佳嘌呤霉素篩選濃度確定 細胞培養(yǎng)液：將嘌呤霉素在0～5 μg/mL范圍內(nèi)按500 ng/mL一個梯度，用培養(yǎng)液稀釋嘌呤霉素制成篩選培養(yǎng)液；嘌呤霉素篩選：棄掉培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液，PBS清洗2次，每孔加入不同濃度篩選培養(yǎng)液，每個梯度3個重復；確定最佳篩選濃度：每12 h，記錄一次細胞生長狀況，3～5 d內(nèi)能夠殺死所有細胞的最小嘌呤霉素濃度即為最佳篩選濃度。最終確定最佳的嘌呤霉素篩選濃度為2 μg/mL。

1.6 RT-PCR鑒定重組慢病毒中hTERT基因 取200 μL重組慢病毒液提取RNA進行RT-PCR，擴增條件同1.2。

1.7 重組慢病毒感染原代綿羊肺成纖維細胞 將原代綿羊肺細胞制成細胞懸液并接種于T25培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后細胞匯合度在80%左右，PBS清洗2次。然后，取500 μL濃縮重組慢病毒液，加入8 μg/mL 聚凝胺，6 h后換成新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，更換為含有10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，內(nèi)含2 μg/mL嘌呤霉素，約4 d后，對照組細胞大面積死亡，將嘌呤霉素維持在1 μg/mL將細胞擴大培養(yǎng)并連續(xù)傳代，約14 d后，轉(zhuǎn)染組細胞形成細胞集落，然后將篩選出來的陽性克隆轉(zhuǎn)移至48孔板，繼續(xù)在1 μg/mL嘌呤霉素的條件下，維持擴大培養(yǎng)，命名為綿羊肺成纖維（sheep lung fibroblast，SLT）細胞。

1.8 基因組水平以及轉(zhuǎn)錄水平檢測hTERT基因 將培養(yǎng)狀態(tài)良好的第10代和第20代SLT細胞，用胰酶消化離心，取沉淀，提取細胞總基因組DNA和RNA，提取過程參照生工生物（上海）股份有限公司試劑盒操作說明書。獲得的RNA進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，分別以cDNA和抽提的細胞基因組DNA為模板，F(xiàn)-qpcr：5'- CGTGGTTTCTGTGTGGTGTC-3'和R-qpcr：5'- CCTTGTCGCCTGAGGAGTAG-3'為鑒定引物。PCR擴增片段大小為214 bp。同時以Hela細胞為陽性對照。PCR反應程序：95℃預變性5 min；94℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸20 s；12℃終止反應。

1.9 Western blot檢測SLT細胞中hTERT 取第10代和第20代SLT細胞，并取Hela細胞作為陽性對照，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，加入細胞裂解液200 μL/瓶，冰上孵育5 min，用細胞刮快速刮下細胞于1.5 mL離心管中，加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃金屬浴10 min，使蛋白變性，10 786×g離心5 min，取上清進行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂乳，4℃封閉過夜，1∶1000稀釋hTERT一抗，37℃孵育2 h，PBST清洗3次，15 min/次，1∶5000稀釋HPR標記山羊抗鼠的二抗，室溫作用1 h，PBST清洗3次，15 min/次，電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）技術(shù)顯色試劑盒進行化學顯色及分析。

2 結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒酶切鑒定 重組慢病毒質(zhì)粒載體pLOV-puro-hTERT經(jīng)NotI單酶切鑒定，在大約3400 bp處有條帶（圖1）。目的片段測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫中hTERT參考序列（NM_198253.2）進行比對分析，結(jié)果顯示，兩者同源性100%；表明重組慢病毒載體pLOV-puro-hTERT構(gòu)建成功。

圖1 酶切鑒定重組慢病毒載體pLOV-puro-hTERTFig.1 Identi fi cation of recombinant lentivirus plasmid pLOV-puro-hTERT digested with NotI

2.2 RT-PCR檢測重組慢病毒中hTERT基因 取200 μL重組慢病毒液提取RNA進行RT-PCR檢測重組慢病毒中hTERT基因，同時以重組質(zhì)粒pLOV-purohTERT為陽性對照，見圖2。

2.3 永生化綿羊肺成纖維細胞的形態(tài) 原代綿羊肺成纖維細胞經(jīng)過重組慢病毒感染和嘌呤霉素篩選后所得的陽性細胞與原代細胞相比具有相似的形態(tài)，為長梭形，具有典型的纖維細胞特征，見圖3。

圖2 RT-PCR檢測重組慢病毒中hTERT基因Fig.2 hTERT gene in recombinant lentivirus detected by RT-PCR

圖3 SLT細胞的形態(tài)Fig.3 Morphology of SLT cells

2.4 PCR及RT-PCR檢測SLT中的hTERT基因 PCR

及RT-PCR在第 10、20代SLT細胞的基因組DNA及cDNA中均能檢出 hTERT基因，而原代SLT細胞未檢測出，見圖4。結(jié)果表明，hTERT 基因成功插入到原代綿羊肺細胞基因組中，并且能夠轉(zhuǎn)錄成mRNA。

2.5 Western blot 分析hTERT基因的表達 分別選取

第10代和第20代SLT細胞并以Hela細胞做陽性對照，進行Western blot檢測。以人源端粒酶抗體為一抗，β-actin為內(nèi)參蛋白。如圖5所示，hTERT在第10代和第20代SLT細胞中均得到有效表達，從而表明SLT細胞能夠穩(wěn)定表達hTERT。

圖4 SLT細胞中hTERT基因的檢測Fig. 4 Identi fi cation of hTERT in SLT cells

圖5 Western blot檢測SLT中hTERT蛋白Fig.5 hTERT protein expressed in SLT cells detected by Western blot

3 討論

原代細胞永生化難度比較大，應用普通的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導細胞實現(xiàn)永生化存在的主要缺陷是無法感染處于非分裂期的細胞，并且在表達外源基因時常常發(fā)生片段丟失；此外，其只容納小片段外源基因，難以兼容多個啟動子，同時還會受到轉(zhuǎn)錄沉默的影響，從而導致較低的感染效率和較差的穩(wěn)定性，這些缺陷在一定的程度上限制了逆轉(zhuǎn)錄病毒的應用[11]。

然而，慢病毒載體是基于人類免疫缺陷病毒-I型為基礎改造而來的一種新型病毒載體，攜帶外源基因的慢病毒載體經(jīng)過包裝質(zhì)粒和包裝細胞系的共同作用下，重組為具有感染力的病毒顆粒，通過感染靶細胞將外源基因插入靶細胞基因組，從而實現(xiàn)外源基因在細胞中的穩(wěn)定表達。高滴度的慢病毒可以感染處于分裂期和非分裂期的細胞并且對正常細胞的表型不會產(chǎn)生影響，其感染能力較強，可以用于感染原代細胞，并且可將目的基因有效整合到宿主基因組中并實現(xiàn)目的基因在宿主中的長期穩(wěn)定的表達。相對于腺病毒和普通的逆轉(zhuǎn)錄病毒而言，使宿主產(chǎn)生較低的免疫反應[12]。此外，由于hTRET的編碼基因含有較高GC含量，從細胞中克隆難度較大，所以本研究以質(zhì)粒pBabe-neo-hTERT為模板，采用infusion技術(shù)將hTERT片段克隆至pLOV-CMV-eGFP載體上，從而高效快捷地構(gòu)建了過表達慢病毒載體pLOV-puro-hTERT。

因此，本研究利用慢病毒系統(tǒng)的優(yōu)點，采用攜帶hTERT基因的重組慢病毒來介導原代綿羊肺成纖維細胞的永生化，經(jīng)過嘌呤霉素的抗性篩選后所獲得的陽性克隆細胞，具有與原代細胞相似的表型和細胞形態(tài)，PCR、RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果均顯示hTERT在傳代細胞組高效表達。目前，永生化綿羊肺成纖維細胞已經(jīng)傳代至第48代，后續(xù)還將對該永生化細胞繼續(xù)傳代并進行生物學特性檢測。

總之，本研究利用攜帶hTERT基因的慢病毒系統(tǒng)成功建立了穩(wěn)定表達hTERT基因的綿羊肺成纖維細胞系，為后續(xù)研究羊源病毒，如小反芻獸疫病毒等分子致病機制和新型疫苗等提供良好平臺。

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