王振玲，王利麗，路 超，楊利峰，郭艷杰

（1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102442；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津300112；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京100093；4.大連醫(yī)科大學(xué)，大連116044）

弓形蟲是細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，寄生于細(xì)胞內(nèi)，隨血液流動，到達(dá)全身各部位，破壞大腦、心臟，致使家畜免疫力下降，引發(fā)各種疾病。孕畜感染后，會出現(xiàn)流產(chǎn)、弱胎、畸胎、死胎和幼畜生長受阻，也可通過胎盤傳染給子代。該病廣泛存在于世界各地，是一種世界性分布、備受重視的寄生蟲病，其終末宿主為貓科動物，而中間宿主范圍十分廣泛，人及大多數(shù)動物感染率都較高。近幾年，由于很多養(yǎng)殖戶對豬的弓形蟲病認(rèn)識不夠，往往在生產(chǎn)實(shí)踐中易被忽視和漏診，弓形蟲病在豬場發(fā)病率開始呈上升趨勢，嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。2017年4月中旬，北京某豬場飼養(yǎng)的20多頭肥豬，體表無異常病變，陸續(xù)出現(xiàn)精神沉郁、食欲不振、行走搖晃、喜臥、呼吸急促等癥狀，解剖發(fā)現(xiàn)肝臟、腎臟上有灰白色壞死點(diǎn)[1,2]，回盲口有扣狀潰瘍等病變[3,4]，并且采用安乃近、頭孢噻呋、氟苯尼考和替米考星等多種藥物進(jìn)行治療，不見明顯效果。本實(shí)驗隨機(jī)選取了3頭發(fā)病豬，采集其前腔靜脈血和病變組織進(jìn)行實(shí)驗室膠體金抗原檢測、PCR檢測、免疫熒光和蛋白免疫印跡檢測。結(jié)果顯示，病豬感染了弓形蟲，而未有豬瘟病毒和豬偽狂犬病毒的感染。

1 材料和方法

1.1 病毒 豬瘟兔化弱毒疫苗購自廣東永順生物技術(shù)有限公司，偽狂犬病毒MinA株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 試劑 HE染色法相關(guān)染色液由實(shí)驗室自配；TaqDNA Polymerase、TIANamp Genomic DNA Kit、血液、細(xì)胞、組織基因組DNA抽提試劑盒均購自天根生物技術(shù)有限公司；TRizol RNA提取試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、5×RT buffer、RNase inhibitor、dNTP、Random primer（50 pmol/μL）、2×GC buffer I、dNTP、DNA Marker、核酸染料goldview等均購自寶生物工程（大連）有限公司。弓形蟲抗血清由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)原蟲病實(shí)驗室饋贈，山羊-豬Cy3抗體及山羊抗豬HRP抗體購自美國Proteintech公司。

1.3 膠體金快速診斷試紙條 豬弓形蟲抗原和豬瘟抗原膠體金檢測試紙條，購自上?？祆`生物技術(shù)有限公司。

1.4 血樣采集 隨機(jī)挑選45公斤左右的發(fā)病豬3頭，前腔靜脈采血，分離血清，用于豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒和弓形蟲檢測。采血后對其進(jìn)行剖檢。

1.5 病料采集 采集剖檢豬的淋巴結(jié)、會厭軟骨、扁桃體、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、膀胱黏膜、腸管。所有臟器分成2份，1份用10%福爾馬林固定病理學(xué)組織檢查；另1份按照常規(guī)方法收集，用于病原體檢測。

1.6 組織病理切片制備和觀察 按照常規(guī)方法制備石蠟切片，切片厚5 μm，HE染色，OLYMPUS U-SRG數(shù)碼顯微鏡觀察并采圖。

1.7 豬弓形蟲病檢測

1.7.1 豬弓形蟲抗原免疫膠體金檢測試紙條進(jìn)行初步檢測 取1.5 mL離心管，采血0. 5～1 mL，3000×g離心10 min，分離血清。按照豬弓形蟲抗原一步法膠體金快速診斷試紙條說明書進(jìn)行操作，檢測弓形蟲抗原。

1.7.2 Western blot鑒定弓形蟲抗體 取5 μg弓形蟲蟲體蛋白（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供）進(jìn)行12%的SDSPAGE。將弓形蟲蟲體蛋白轉(zhuǎn)印PVDF膜后，剪下3個泳道的PVDF膜分別孵育病豬血清、正常豬血清、人工感染弓形蟲的陽性豬血清（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)原蟲實(shí)驗室提供），洗膜3次后，孵育山羊抗豬HRP二抗，PBS洗膜3次后，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測結(jié)果。

1.7.3 免疫熒光檢測弓形蟲 將弓形蟲鋪于6孔板，應(yīng)用0.3% Triton X-100作用10 min，3% 胎牛血清封閉，一抗分別孵育病豬血清、正常豬血清、人工感染弓形蟲的陽性豬血清；二抗為山羊-豬Cy3，熒光顯微鏡下觀測結(jié)果。

1.8 豬瘟病毒抗原檢測

1.8.1 膠體金檢測卡 應(yīng)用上面1.4分離的血清，按照豬瘟病毒抗原一步法膠體金快速診斷試紙條說明書進(jìn)行操作，檢測豬瘟抗原。

1.8.2 RT-PCR檢測 按照TRizol提取RNA法提取3頭發(fā)病豬的淋巴結(jié)、肺臟和脾臟中的RNA，參照文獻(xiàn)[5]所述方法進(jìn)行RT-PCR檢測。

1.9 豬偽狂犬病毒PCR檢測

1.9.1 引物及PCR反應(yīng)參數(shù) 選擇豬偽狂犬病病毒gE基因中保守的核苷酸序列設(shè)計1對引物。U3：5'-AT GGGCATCGCCGACTACCT-3'，L3：5'-CCACCG CCACAAAGAACAG-3'。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：2×GC buffer I 10 μL，dNTP 2 μL，U3、L3引物各1 μL，模板5.5 μL，Taq酶0.5 μL，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；終末延伸72℃ 10 min。按照TIANamp Genomic DNA Kit法提取3頭發(fā)病豬的腦、肺臟和肝臟中的DNA。

1.9.2 樣品檢測 按照上述PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 剖檢病理變化 3頭發(fā)病豬的病理變化基本相同，均見有回盲口扣狀潰瘍（圖1A、B、C）；腹股溝淺淋巴結(jié)正常，腹股溝深淋巴結(jié)切面周邊出血；會厭軟骨、扁桃體、膀胱黏膜均無異常病理變化；脾臟一端淤血（圖1D）；肝臟表面有少量散在白色斑點(diǎn)（圖1E）；腎臟表面有大量散在白點(diǎn)，切開腎臟，皮質(zhì)、髓質(zhì)未見出血點(diǎn)（圖1F）。

圖1 剖檢病理變化Fig.1 Pathological changes

圖2 發(fā)病豬的組織病理學(xué)檢查Fig.2 Pathological examination of sick pig tissue

2.2 組織病理變化 低倍鏡下，回盲口絨毛脫落，不完整（圖2A），高倍鏡下，杯狀細(xì)胞增多，粘液分泌亢進(jìn)，固有層有大量炎性細(xì)胞浸潤，局部腸腺上皮細(xì)胞壞死、脫落（圖2B）；低倍鏡下，可見肝小葉間質(zhì)顯著增寬、增厚（圖2C），高倍鏡下，可見匯管區(qū)膽管增生，大小數(shù)量不一，間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤（圖2D、E）；肺臟病變處顯示肺泡結(jié)構(gòu)幾乎消失，肺泡腔內(nèi)充滿大量巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞及吞噬崩解后的細(xì)胞碎片等（圖2F）；部分腎小管上皮細(xì)胞增生、腫脹、脫落，細(xì)胞界限不清晰，胞漿淡染，胞核擠向一側(cè)，部分細(xì)胞破裂脫落至管腔中，局部區(qū)域有大量藍(lán)染淋巴樣細(xì)胞聚集，細(xì)胞呈圓形、橢圓形，核質(zhì)比高，胞漿較少（圖2G、H、I）；脾臟紅白髓界限不清，部分紅細(xì)胞破裂、溶解（圖2J）。

2.3 弓形蟲檢測結(jié)果

2.3.1 弓形蟲抗原免疫膠體金檢測 對采集的3份血清應(yīng)用弓形蟲抗原免疫膠體金檢測試紙條檢測，結(jié)果均為陽性，見圖3A。

2.3.2 Western blot檢測 Western blot檢測病豬弓形蟲血清抗體的結(jié)果顯示，人工感染弓形蟲的陽性對照豬血清及病豬血清內(nèi)弓形蟲抗體檢測的信號較強(qiáng)，而正常豬血清內(nèi)檢測不到弓形蟲抗體，見圖3B。以上結(jié)果說明，病豬存在明顯的弓形蟲感染。

2.3.3 免疫熒光檢測 應(yīng)用免疫熒光檢測結(jié)果顯示，人工感染弓形蟲的陽性對照豬血清及病豬血清內(nèi)能夠檢測到與弓形蟲結(jié)合的抗體，而正常豬血清內(nèi)則檢測不到弓形蟲抗體，見圖4。以上結(jié)果說明，發(fā)病豬體內(nèi)存在弓形蟲感染。

圖3 弓形蟲檢測結(jié)果Fig.3 Detection results of Toxoplasma gondii

圖4 免疫熒光檢測弓形蟲感染Fig.4 Immuno fl uorescence assay of Toxoplasma gondii infection

2.4 豬瘟病毒抗原檢測結(jié)果 應(yīng)用豬瘟病毒抗原膠體金檢測試劑卡對采集的3份血清進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性（圖5A）。對采集的3份發(fā)病豬樣品進(jìn)行豬瘟病毒RT-PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳未見預(yù)期目的條帶，說明樣品中未檢出豬瘟病毒，見圖5B。

2.5 豬偽狂犬病毒gE基因PCR檢測 對采集的發(fā)病豬樣品進(jìn)行豬偽狂犬病毒PCR檢測，3份樣品均為陰性，見圖6。

圖5 豬瘟病毒抗原檢測結(jié)果Fig.5 Swine fever virus antigen detection results

圖6 豬偽狂犬病毒gE基因PCR檢測結(jié)果Fig. 6 PCR detection of Pseudorabies virus gE gene

3 討論

在臨床診斷過程中，結(jié)合病豬臨床癥狀和死后剖檢變化，很難鑒別豬瘟、豬偽狂犬病和豬弓形蟲病。董筱萍[6]報道，腦炎、肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)的出血和灰白色壞死點(diǎn)是豬偽狂犬病主要特征性剖檢病變，這些臟器的病理組織變化呈局灶性核碎裂性壞死和出血。本病例肝臟表面有白點(diǎn)，病理組織切片觀察肝小葉間質(zhì)顯著增寬、增厚、有大量炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)膽管增生，大小數(shù)量不一，并未呈現(xiàn)典型的局灶性核碎裂性壞死和出血特征，與豬偽狂犬病肝臟的灶性壞死有些不同。豬腎臟表面有大量針尖大白點(diǎn)，病理組織學(xué)變化顯示部分腎小管上皮細(xì)胞增生、腫脹、脫落，細(xì)胞界限不清晰，胞漿淡染，胞核擠向一側(cè)，部分細(xì)胞破裂脫落至腎小管管腔中，腎小管上皮細(xì)胞的損傷特征與豬圓環(huán)病毒（斷奶仔豬多系統(tǒng)綜合征）導(dǎo)致的非化膿間質(zhì)性腎炎略有不同[7]，所以，僅通過肉眼觀察，對豬瘟、豬偽狂犬病、豬弓形蟲病進(jìn)行鑒別困難很大，還應(yīng)結(jié)合疾病流行病學(xué)特點(diǎn)、病理變化及實(shí)驗室檢測進(jìn)行綜合分析，做出準(zhǔn)確結(jié)論，確定科學(xué)的免疫防控程序，更好地指導(dǎo)生產(chǎn)。

豬弓形蟲病診斷方法有臟器直接觸片染色檢查、間接血球凝集試驗、動物接種及染色試驗、中和抗體試驗、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、熒光抗體反應(yīng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗等。在這些方法中，直接觸片染色檢查很難直接查到弓形蟲病原，極易出現(xiàn)漏檢。中和抗體試驗、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、熒光抗體反應(yīng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗有敏感、特異等特點(diǎn)，但由于分子生物學(xué)檢測需要特殊的儀器設(shè)備，技術(shù)相對復(fù)雜，對實(shí)驗室條件和操作人員的要求比較高，比較適用于實(shí)驗室研究，不能向基層廣大獸醫(yī)人員進(jìn)行推廣應(yīng)用。有資料報道[8]，常規(guī)組織染色的病理組織切片的病變特征和弓形蟲的結(jié)構(gòu)可確認(rèn)弓形蟲蟲體，但實(shí)際上經(jīng)多次進(jìn)行病理組織切片觀察時，很難在腦、肺臟等弓形蟲感染的多個臟器里面切到病原，主要原因是在制片過程中很難切到有4～8 μm×2～4 μm大小的速殖子或緩殖子的部位。迄今為止，豬弓形蟲抗原檢測試紙條是養(yǎng)殖戶或技術(shù)人員比較容易接受的快速檢測方法。本次試驗采用弓形蟲免疫熒光和蛋白免疫印跡檢測結(jié)果與膠體金檢測方法吻合度較高，更加印證了這個觀點(diǎn)。

在養(yǎng)殖過程中，大家都很注意養(yǎng)、繁、防、治這四方面的管理，也特別強(qiáng)調(diào)這四個方面的重要性，但有時還會出現(xiàn)防不勝防的這樣或那樣的疾病發(fā)生。在近幾年對各大豬場進(jìn)行技術(shù)服務(wù)的過程中，經(jīng)常遇到不同日齡階段的豬感染弓形蟲病 。對于這些病豬，采用臨床癥狀和病理剖檢很難作出診斷，尤其在有回盲口扣狀潰瘍這種病變的前提下，常常容易誤診為慢性豬瘟。本研究通過病理組織學(xué)觀察、豬瘟病毒抗原的膠體金檢測和PCR檢測證明，發(fā)病豬未有豬瘟病毒感染。由此，說明對疑似病料做進(jìn)一步診斷研究非常有必要，誤診將會誤導(dǎo)豬場免疫防控措施的制定，甚至帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

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