荊雅瑋，陳芳芳，左佳坤，胡劍剛，石欣池，米榮升，黃 燕，陳兆國，韓先干

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥230036）

鴨疫里默氏桿菌（Riemerellaanatipestifer，RA）感染引起鴨疫里默氏桿菌病，又稱鴨傳染性漿膜炎，是主要發(fā)生于鴨的一種慢性或急性高度接觸傳染病，特別是雛鴨的病死率較高。目前該病在世界各國養(yǎng)鴨地區(qū)均有流行，是鴨群中常見的細菌性病原[1]。

RA在自然界分布廣泛，血清型眾多，目前已確定的RA至少有21個血清型[2,3]，并且不同血清型之間無交叉免疫保護作用。此外，由于臨床抗菌藥物的濫用，導致RA出現(xiàn)多重耐藥[4]，嚴重制約該病的防控[5,6]。

研究表明，RA的毒力因子、群體感應系統(tǒng)（quorum sensing）和生物被膜（biofilm）等對其生物學特性具有重要的調(diào)控作用。群體感應系統(tǒng)信號分子AI-2能影響RA的生物被膜形成[7]及其對Vero細胞的粘附[8,9]，TonB和ompA影響RA的致病性[10]。與禽致病性大腸桿菌和沙門菌等禽的致病菌研究相比，RA的相關研究亟需加強。因此開展RA分子流行病學研究及致病機制的研究，為該病的防控提供技術支撐。

本實驗室2017年從安徽不同養(yǎng)殖場的送檢病鴨中分離8株RA。本研究對這8株分離株開展了血清型、抗菌藥物敏感性和生物被膜形成等生物學特性研究，以期為安徽省鴨疫里默氏桿菌病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑 用于RA培養(yǎng)的TSB培養(yǎng)基購自美國BD公司；瓊脂糖、2×TaqPCR Mix、DL2000 DNA Marker購自康為世紀生物科技有限公司；PrimeScript RT Reagent Kit（Perfect real time）購自寶生物工程（大連）有限公司；Trizol Regent 購自Life Technology公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司和杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 鴨疫里默氏桿菌的PCR鑒定及血清型鑒定 根據(jù)GenBank 中登錄的RA16S rRNA和GroEL基因序列，利用 Primer Premier 5.0軟件設計引物（表1），對從安徽省不同地區(qū)的3個養(yǎng)殖場送檢的病死鴨的心臟、肝臟、脾臟等器官中分離的菌株進行PCR檢測。

表1 引物序列表Table 1 Primer Sequences

將分離鑒定的RA菌株接種于TSB瓊脂平板中（TSA)，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出單菌落之后，挑取單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)后將菌液離心3次后，用PBS將菌體重懸，作為RA分離株玻片凝集抗原。取5 μL上述制備的RA凝集抗原分別和5 μL不同RA陽性血清在玻片上混勻，并分別以對應血清型的陽性菌株作為凝集反應陽性對照，以大腸桿菌和PBS作為凝集反應陰性對照和空白對照，鑒定RA血清型 。結(jié)果判定標準：凝集抗原與血清混合之后3 min內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀凝集者為陽性（+），不出現(xiàn)顆粒狀凝集者為陰性（-）。

1.3 鴨疫里默氏桿菌的藥物敏感性檢測 參照美國臨床和實驗室標準化研究所（CLSI）制定的抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準，并參照臨床常用的抗菌藥物，選取24種抗菌藥物（表2），將新鮮培養(yǎng)的菌液均勻涂布于TSB瓊脂平板上，分別將各藥敏紙片均勻貼于TSB瓊脂平板上，將平板置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，觀察并記錄各抑菌圈直徑大小。參照CLSI標準，判定被檢細菌對每種藥物的敏感性，分別為敏感（susceptible，S）、中敏（intermediate，I）和耐藥（resistance，R）菌株。

1.4 鴨疫里默氏桿菌的生物被膜檢測 參照文獻[11]的方法，將8株RA分離株分別接種于TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為1.0，用TSB按1∶10的比例進行稀釋，在Corning的U型底96孔板中分別加入稀釋好的菌液，每孔200 μL，每株菌設置8個重復，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中分別靜置培養(yǎng)36 h。用結(jié)晶紫染色法檢測各株菌的生物被膜形成情況，具體方法：RA靜置培養(yǎng)36 h時后棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入200 μL無菌PBS，洗去游離的細菌，重復2次；自然晾干后，每孔加入200 μL 0.1%的結(jié)晶紫，室溫染色30 min；棄去結(jié)晶紫，PBS洗3次，自然晾干后每孔加入200 μL的95%乙醇溶液，充分溶解后用酶標儀檢測各孔的OD595值。參照文獻[12]的方法，將RA的生物被膜形成能力分為4個等級：OD＜ ODC，為不形成生物被膜株（OD為被檢測細菌的OD595，ODC為陰性對照的OD595）；ODC＜OD＜2ODC，為弱生物被膜形成株；2ODC＜ OD＜4ODC為中等生物被膜形成株；4 ODC＜ OD，為強生物被膜形成株。所有樣品重復8次，取8次結(jié)果的平均值作為判定標準。

表2 抗菌藥物Table 2 Antibacterials

1.5 鴨疫里默氏桿菌總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 將培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（OD600=1.0）的RA, 參照 Trizol法提取總RNA的方法，提取RA的總RNA，提取的總RNA通過NanoDrop ND-1000分光光度計測定其濃度及純度。RNA樣品經(jīng)濃度和純度檢測后，采用PrimeScript RT Mster Mix 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.6 real-time熒光定量 PCR檢測不同RA菌株與生物被膜形成相關的基因轉(zhuǎn)錄情況 參照文獻[13]的方法，選取5個顯著影響RA生物被膜形成的基因，分別為Rien_0023、Rien_0186、Rien_1039、Rien_0339和Rien_1564。依據(jù)其基因序列，應用軟件Primer primier 5.0 設計引物（表1），并由上海英濰捷基（英俊）貿(mào)易有限公司合成，采用 GoTaqqPCR Mster Mix試劑盒進行實時熒光定量PCR來檢測不同生物被膜形成能力菌株間基因的轉(zhuǎn)錄水平。每個基因進行3次生物學重復，數(shù)據(jù)通過內(nèi)參基因乳酸脫氫酶（L-lactate dehydrogenase gene，Idh）進行標準化，應用2-△△ct（Livak）法進行計算[8]。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離鑒定結(jié)果及血清型鑒定結(jié)果 將分離到的疑似RA菌株，分別用16S rRNA和GroEL特異性引物進行PCR鑒定，結(jié)果表明，分離到的8株菌株均為鴨疫里默氏桿菌，分別命名為AH-1、AH-2、AH-3、AH-4、AH-5、AH-6、AH-8和AH-35，見圖1。血清型鑒定結(jié)果表明，AH-4和AH-5為血清型15，AH-1、AH-2、AH-3、AH-6、AH-8和AH-35均為血清型10，見表3。

圖1 RA 16S rRNA(A)和GroEL(B)基因PCR鑒定Fig 1 Identi fi cation of RA 16S rRNA(A) and GroEL(B)by PCR

表3 RA菌株血清型鑒定結(jié)果Table 3 The results of RA strains serotype detection

2.2RA菌株藥物敏感性檢測實驗 對8株鴨疫里默氏桿菌的抗菌藥物敏感性檢測結(jié)果表明，AH-1對17種抗生素耐藥, 而AH-35僅對7種抗生素耐藥，見表4。8株菌對阿莫西林/棒酸均敏感；7株菌株對頭孢吡啶和頭孢他啶敏感；8株菌洛美沙星，阿奇霉素均耐藥；除AH-1外的7菌株對8種抗生素均耐藥，分別為克林霉素、甲氧嘧啶、紅霉素、利福平、阿米卡星、四環(huán)素、洛美沙星和阿奇霉素，見表5。

表4 8株RA的藥敏結(jié)果Table 4 Drug susceptibilities results of 8 RA isolates

2.3RA菌株生物被膜形成能力檢測 對8株菌株的生物被膜檢測結(jié)果，見圖2。結(jié)果顯示，7株菌株（菌株AH-1、AH-2、AH-3、AH-4、AH-5、AH-6和AH-8）具有強生物被膜形成能力（4 ODC＜OD），其中AH-1的形成能力最強；具有弱生物被膜形成能力的菌株有1株，為AH-35。AH-1與AH-35的生物被膜形成能力具有極顯著統(tǒng)計學意義（p＜0.0001）。

表5 RA菌株的耐藥表型Table 5 The resitance-phenotype of RA strains

2.4 real-time熒光定量PCR檢測結(jié)果 選取 5個顯著影響RA生物被膜形成的基因，對菌株AH-1和AH-35中的生物被膜形成有關基因進行real-time熒光定量PCR檢測，其結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，AH-1與AH-35菌株相比，除Riean_0186、Riean_0039的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)之外，Riean_0023、Riean_1039和Riean_1564基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)（p＜0.01）。

3 討論

圖2 不同菌株生物被膜形成檢測結(jié)果Fig.2 Bio fi lm formation assay of different isolates

圖3 生物被膜相關基因表達水平檢測結(jié)果Fig 3 The transcriptional levels of selected genes in AH-1 and AH-35

鴨疫里默氏桿菌的血清型有21種，由于RA的血清型眾多，并且不同血清型之間缺乏免疫交叉保護，從而嚴重制約該病的防控。研究表明，我國分離的RA血清型有18種，其中血清1、2、6、10型為優(yōu)勢血清型[14]。林樹乾[15]和吉鳳濤等[16]的研究表明，吉林省主要流行的RA血清型為1型和2型；袁小遠等[17]對山東和河北地區(qū)的RA流行病學調(diào)查表明，血清1型為其主要流行血清型；程龍飛等[18]對福建省RA研究表明，血清2型和11型為優(yōu)勢血清型。而本研究在對8株RA安徽分離株血清型的鑒定結(jié)果表明，6株為血清10型，2株為血清15型，表明在我國不同地區(qū)鴨疫里默氏桿菌主要流行的血清型并不相同。因此各地在開展RA的防控時，應對該地區(qū)的優(yōu)勢血清型進行鑒定，選擇相應血清型的疫苗進行防控。

在對鴨疫里默氏桿菌病的治療中，抗菌藥物的使用一直是重要措施，但由于抗生素的濫用，使得RA臨床分離株的耐藥性和交叉耐藥性越來越強。陸新浩等[19]對寧波地區(qū)的RA進行抗菌藥物檢測，結(jié)果表明80%以上細菌對慶大霉素、阿米卡星、壯觀霉素、復合磺胺耐藥；李兆華[20]對山東省部分地區(qū)的菌株檢測結(jié)果表明，19株鴨疫里默氏桿菌總體上對卡那霉素、丁胺卡那、青霉素、新霉素耐藥。而本實驗分離的8株菌株，分別對克林霉素、甲氧嘧啶、紅霉素、利福平、阿米卡星、四環(huán)素、洛美沙星和阿奇霉素8種抗生素耐藥。與上述結(jié)果有較大出入，表明不同地區(qū)的耐藥性和交叉耐藥性并不相同。因此在對RA的治療中，應結(jié)合當?shù)氐哪退幥闆r合理使用抗菌藥物。

研究表明，Riean_0023（dhdps）基因是影響某些細菌賴氨酸生物合成的重要基因，在RA中，dhdps缺失導致其生物被膜形成能力[13]顯著降低；而Riean_1039（ftsQ）基因則通過影響細胞質(zhì)膜蛋白的形成從而影響到細胞的分裂，進而影響生物被膜的形成。本實驗結(jié)果顯示，與弱生物被膜形成株AH-35相比，強生物被膜形成株AH-1的Riean_0023、Riean_1039和Riean_1564基因的表達水平均顯著上調(diào)（p＜0.01），表明上述3個基因能夠?qū)A的生物被膜的形成具有調(diào)控作用。研究表明，細菌的耐藥性與生物被膜的形成有關，本研究結(jié)果表明，強生物被膜形成株AH-1對17種抗菌藥物耐藥；而弱生物被膜形成株AH-35僅對7種抗菌藥物耐藥，表明在RA中，生物被膜形成能力強的菌株，對抗菌藥物耐藥性也顯著增強，表明RA生物被膜的形成與其耐藥性具有一定的相關性[21]。

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