墨海峽，陳雪姣，周 鵬，江 濤，歐陽(yáng)金旭，楊玉瑩，汪招雄

（1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，荊州434025；2.湖北省荊州市畜牧獸醫(yī)局，荊州434020）

禽腺病毒（Fowl Adenovirus，F(xiàn)AV）根據(jù)群特異性抗原的不同分為三個(gè)群，Ⅰ群禽腺病毒（FAV1）具有共同的群抗原，包括傳統(tǒng)的禽腺病毒及其他禽類分離物，共12個(gè)血清型，代表株為雞胚致死孤兒病毒（Chicken embryo lethal orphan virus，CELOV），屬于血清1型腺病毒。該群病毒在雞、鴨和鵝體內(nèi)普遍存在，能使雞群呈現(xiàn)隱性感染，可作為繼發(fā)病原與其它病原共同作用家禽，并能垂直傳播，污染雞胚。雞Ⅱ群禽腺病毒可以引起火雞出血性腸炎（hemorrhagic enteritis，HE）、雛雞大理石脾?。╩arble spleen disease，MSDA），這些病毒具有一種與Ⅰ群病毒不同群的抗原，自然界中也存在著無(wú)病原性的這類腺病毒并可作免疫預(yù)防；Ⅲ群腺病毒，即與減蛋綜合征（egg drop syndrome，EDS）有關(guān)的一類病毒，可從雞、鴨、鵝體內(nèi)分離獲得，致病性差異很大，部分含有Ⅰ群腺病毒的共同抗原。

“心包積水—肝炎綜合癥”（hydropericardium hepatitis syndrome，HHS）是由血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus type 4，F(xiàn)AV 4）引起的一種家禽疾病。典型癥狀是3～5周齡肉雞、蛋雞青年雞、黃雞及麻雞突然死亡，并伴隨有心包積水和肝炎。1963年Helmboldt 等在美國(guó)的肉用仔雞中首次發(fā)現(xiàn)該病[1-3]，之后墨西哥、加拿大、日本、澳大利亞等許多國(guó)家均報(bào)道有本病的發(fā)生[4,5]。1976 年，我國(guó)臺(tái)灣首次報(bào)道了該病，隨后遼寧省、吉林省、湖南省、江蘇省和河南省等相繼也發(fā)現(xiàn)該病的存在[6,7]。

本試驗(yàn)通過(guò)采集疑似“心包積水—肝炎綜合癥”蛋雞肝臟，研磨無(wú)菌處理后接種SPF雞胚分離病毒，提取DNA，經(jīng)過(guò)對(duì)FAVhexon基因序列分析，確定分離的病毒為Ⅰ群4型禽腺病毒，通過(guò)動(dòng)物回歸試驗(yàn)，了解該病發(fā)病的臨床癥狀和病理變化。

1 材料和方法

1.1 材料 疑似“心包積水-肝炎綜合癥”病死蛋雞來(lái)源于湖北省荊州市、宜昌市和荊門市規(guī)?；半u場(chǎng)。

1.2 試劑 DNA提取試劑盒、dNTP、ExTaq酶、DNA Marker、pMD19-T載體購(gòu)于TaKaRa公司。

1.3 病毒分離 無(wú)菌采集病雞肝臟，按1∶5的比例加入滅菌生理鹽水研磨成懸液，反復(fù)凍融3次后，5000 ×g離心20 min，上清用0.22 μm微孔濾器過(guò)濾，吸取0.2 mL濾液接種9～11日齡SPF雞胚；棄24 h內(nèi)死胚，取接種后48 ～72 h未死亡的雞胚放于4℃冰箱保存5 h，收取尿囊液，盲傳3代后，收集尿囊液-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)菌的分離 無(wú)菌取肝臟及心包積液，在麥康凱瓊脂平板和血平板進(jìn)行細(xì)菌分離，培養(yǎng)12 h，觀察結(jié)果。

1.5 病毒基因組的提取 用TaKaRa試劑盒提取病料中病毒 DNA和RNA，按照試劑盒提供的方法操作。

1.6 PCR反應(yīng) 根據(jù)GenBank 上已發(fā)表的1群腺病毒hexon基因序列，設(shè)計(jì)3對(duì)引物。H1：5'-TGGA CATGGGGGCGACCTA-3'；H2：5'-AAGGGATT GACGTTGTCCA-3'；H3：5'-AACGTCAACCCC TTCAACCACC-3'，H4：5'-TTGCCTGTGGCG AAAGGCG-3'；FAV4-F：5'-CGGGATCCA TGTCAGCAGTAGGCGATT-3'，F(xiàn)AV4-R：5'-CCCAAGCTTTTACACGGCGTTGCT-3'。其中引物H1、H2擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1219 bp；引物H3、H4擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為1350 bp；引物FAV4-F、FAV4-R擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為295 bp。引物用滅菌ddH2O稀釋到20 μmol/mL，-20℃保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)體系為25 μL：DNA模板2 μL、10×PCR buffer（含Mg+）2.5 μL、dNTP 2 μL、ExTaq酶 0.25 μL、上下游引物各1 μL、補(bǔ)充ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；然后95℃變性1 min、56℃退火2 min、72℃延伸90 s、30個(gè)循環(huán)；72延伸10 min。1.7 PCR產(chǎn)物回收，連接及測(cè)序 經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)，切下與目的條帶大小一致的片段，用試劑盒回收純化。取回收產(chǎn)物與pMD-19T載體16℃連接8 h，轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細(xì)菌，涂布到選擇性Amp平板，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落接種5 mL 含Amp的LB液體培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，37℃培養(yǎng)3～5 h，對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定，并送武漢擎科創(chuàng)新生物有限公司測(cè)序 。

1.8 序列比較 采用 DNAStar 軟件系統(tǒng)進(jìn)行將序列與禽腺病毒各群hexon序列進(jìn)行分析，通過(guò)hexon基因序列區(qū)分血清型。參考的禽腺病毒信息，見表1。

表1 禽腺病毒信息表Table 1 The information of the cited sequences

1.9 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn) 將40只30日齡健康雛雞隨機(jī)分為兩組，每組20只。A組為試驗(yàn)組，每只頸部皮下注射病毒尿囊液0.2 mL，B組為對(duì)照組，每只接種0.2 mL無(wú)菌生理鹽水。雞群感染后連續(xù)觀察15 d，記錄飲水、采食和死亡情況，并將試驗(yàn)組未死亡雞和對(duì)照組雞均解剖觀察病理變化；試驗(yàn)組死亡雞和未死亡雞以及對(duì)照組雞肝臟處理后，用PCR檢測(cè)FAV4。

2 結(jié)果

2.1 眼觀病理變化 臨床發(fā)病雞心臟上有黃色果凍狀心包積液（圖1A），肝臟呈現(xiàn)土黃色和出血點(diǎn)（圖1B、E），腎臟腫大、蒼白，脾臟腫大，腺胃在乳頭基底部，靠肌胃交界處出血（圖1C、D、F）。

2.2 細(xì)菌分離 將病料接種于麥康凱瓊脂平板和血平板分離培養(yǎng)24 h左右后，均未觀察到任何細(xì)菌生長(zhǎng)，可以排除細(xì)菌感染。

圖1 不同器官病理變化Fig. 1 The pathological changes of different organs

2.3 PCR 擴(kuò)增結(jié)果及產(chǎn)物的克隆 對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，與預(yù)期的目的片段大小相符，H1、H2引物擴(kuò)增結(jié)果見圖2A，H3、H4引物擴(kuò)增結(jié)果見圖2B，F(xiàn)AV-4引物擴(kuò)增結(jié)果見圖2C。

圖2 不同引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The result of PCR ampli fi cation products by different primers

2.4 基因序列分析 3株來(lái)自不同雞場(chǎng)病毒的基因同源率為100%。將分離毒株核苷酸序列與其他參考株病毒核苷酸序列（見表1）進(jìn)行比較。結(jié)果如圖3所示，分離的病毒與Ⅰ群禽腺病毒同源性相對(duì)較高，與2016年湖北武漢分離的HB1510株同源性最高，達(dá)到99.8%，與2003年加拿大分離到的Ⅰ群9血清型A-2A株的核苷酸序列相似性為69.6%，與鵝腺病毒4型P29株的同源性是64.2%，與人腺病毒C的同源性是45.9%；分離的毒株與Ⅱ群禽腺病毒2008年以色列分離出來(lái)的雞出血性腸炎病毒同源性是43.3%，與2012年匈牙利分離得到的火雞出血性腸炎病毒D90/2株同源性為78.6%，與美國(guó)2008年分離得到的同源性最高是43.1%；分離的毒株和Ⅲ群禽腺病毒的減蛋綜合征病毒（GenBank登錄號(hào)：Y09598）的同源率為43.8%。

遺傳進(jìn)化樹顯示，本實(shí)驗(yàn)分離株與Ⅰ群FAV親緣關(guān)系最近，特別是與血清4型更接近。分離株與選取的禽腺病毒4血清型參考毒株在同一分支上，與Ⅰ群的其他血清型在不同分支，Ⅱ群和Ⅲ群?jiǎn)为?dú)在一個(gè)分支上，結(jié)果見圖4。

2.5 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)

2.5.1 臨床癥狀和病理變化 試驗(yàn)組在第3 d，2只雞發(fā)病并出現(xiàn)急性死亡，部分雞只精神沉郁、食欲減退，個(gè)別出現(xiàn)拉黃綠色糞便。在第4 d和第5 d出現(xiàn)死亡高峰期，15 d內(nèi)死亡率達(dá)到60%；死亡雞只心臟有心包積液；肝臟出血，部分出現(xiàn)土黃色腎臟腫大；腎臟腫脹、有出血點(diǎn)，輸尿管尿酸鹽沉積；腸道出血、腺胃出血。對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)發(fā)病癥狀和死亡現(xiàn)象，心臟和肝臟正常。

2.5.2 PCR檢測(cè)結(jié)果 將試驗(yàn)組死亡雞和未死亡雞，以及對(duì)照組雞均采集肝臟抽提DNA，用FAV-4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，試驗(yàn)組死亡雞和試驗(yàn)組未死亡雞均呈陽(yáng)性，而對(duì)照組雞PCR擴(kuò)增陰性。

2.6 病理組織學(xué)觀察結(jié)果 攻毒組急性死亡雞只病理切片如圖5A所示，肝臟發(fā)生明顯脂肪變性，同時(shí)有顆粒變性和水泡變性，無(wú)壞死現(xiàn)象，部分淤血出現(xiàn)；典型心包積水肝炎綜合征的死亡雞只病理切片如圖5B所示，肝臟發(fā)生壞死，核濃縮，甚至部分消失，淤血明顯；攻毒組未死亡雞只如5C圖所示，肝臟發(fā)生變性；5D圖為對(duì)照組雞只肝臟。

3 討論

雞心包積水-肝炎綜合征的病理特征是心包積液和肝炎，同時(shí)心包積液也是禽類的一種疾病。通過(guò)病毒分離，可以用電子顯微鏡確定其與禽腺病毒有關(guān)。心包積液的病毒屬于FAV4型，并且是高致病性的。從肝臟和雞胚盲傳3代后的尿囊液中均檢測(cè)到FAV4，但是心包積液中未檢測(cè)出。與2015年王婉等[8]試驗(yàn)結(jié)果不太一樣，能直接用肝臟組織分離到病毒。

在之前的報(bào)道中，典型癥狀一般是3～5周齡肉雞、蛋雞青年雞、黃雞及麻雞。在該病例中，從湖北地區(qū)40、60和240日齡的蛋雞中均能分離出禽腺病毒，并且出現(xiàn)大面積死亡現(xiàn)象，說(shuō)明該病毒目前廣泛發(fā)生并且出現(xiàn)發(fā)病日齡擴(kuò)大的趨勢(shì)。

將病死雞與動(dòng)物攻毒組發(fā)病雞解剖病理比較分析，都有黃色果凍狀心包積液產(chǎn)生，心臟出現(xiàn)黃染；肝臟上有出血點(diǎn)，有些肝臟變成土黃色。送檢病料中腎臟、脾臟病變比較明顯，腎臟腫大，有現(xiàn)尿酸鹽沉積，脾臟腫大明顯，送檢病料中腺胃乳頭基底部靠近肌胃交界處有出血點(diǎn)，個(gè)別腿肌出血。而攻毒組腎臟腫大不明顯，有尿酸鹽沉積，脾臟無(wú)明顯病變，沒(méi)有腫大現(xiàn)象，而在肌胃腺、胃和腿肌均無(wú)出血點(diǎn)。

圖3 分離株與參考毒株核苷酸序列分析Fig. 3 Nucleotide sequence analysis between isolates and reference strains

圖4 分離株與參考毒株生物進(jìn)化樹分析Fig. 4 The analysis evolutionary tree between isolates and reference strains

圖5 病理組織圖（10×40）Fig.5 The pathological chart（10×40）

近年來(lái)，越來(lái)越多FAdV不同血清型毒株引起的疾病在很多國(guó)家有報(bào)道[9-11]，有些FAdV血清型毒株對(duì)雞具有高致病性，引起很大的經(jīng)濟(jì)損失[12-15]。在中國(guó)，從2012年以來(lái)疫情呈上升趨勢(shì)，大多數(shù)情況下導(dǎo)致3～5周齡肉雞發(fā)病，偶爾發(fā)生于10～20周齡母雞。在這些爆發(fā)的死亡率范圍從輕微的增加到超過(guò)30%。

目前，在該病毒的基因中，hexon基因是研究范圍最廣的，具有群與型的特異性，包括4個(gè)可變環(huán)L1～L4結(jié)構(gòu)，不同毒株的hexon基因序列均已公布，本實(shí)驗(yàn)中，用hexon基因序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增與克隆，測(cè)序片段包括了該基因的全序列，分離株與Ⅰ群FAV同源率最高，親緣關(guān)系最近，特別是血清4型。而與Ⅱ群、Ⅲ群親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，屬于不同的進(jìn)化支，本研究為進(jìn)一步研究心包積水-肝炎綜合癥奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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