馬麗敏，賈俊婷，鐘亞迪，范 瑞，馬玉媛，劉興友，章金剛,3

（1.河南科技學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000；2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所，北京 100850；3. 新鄉(xiāng)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000）

猴B病毒（Monkey B virus，即Macacine alphaherpesvirus 1）是一種人畜共患病病原，其自然宿主是獼猴，在猴群中廣泛存在，多呈良性經(jīng)過。人感染猴B病毒后可引起腦脊髓炎甚至致死，未經(jīng)治療死亡率高于70%[1,2]。猴B病毒是目前確定的35種非人靈長類皰疹病毒中唯一一種已知對人有致病性的病毒[3]。根據(jù)2011年我國頒布實施的實驗動物微生物學(xué)等級及檢測國家標(biāo)準(zhǔn)，猴B病毒已被列為普通級實驗用猴應(yīng)排除的病原微生物[4]。因此，建立快速、準(zhǔn)確檢測猴B病毒的方法對于相關(guān)人員暴露后的快速診斷和治療以及對建立高質(zhì)量的實驗猴群都具有非常重大的意義。

現(xiàn)有的猴B病毒檢測方法主要包括病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測和核酸檢測。病毒分離培養(yǎng)是檢測猴B病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法靈敏度低、耗時長，并且對操作條件要求非常高；血清學(xué)檢測中，由于猴B病毒與人單純皰疹病毒1型（Herpes simplex virus 1，HSV-1）、人單純皰疹病毒2型（Herpes simplex virus 2，HSV-2）、非洲綠猴皰疹病毒（Simian agent 8，SA8）、及狒狒皰疹病毒（Herpesvirus papio 2，HVP-2）存在廣泛的抗原交叉性，易導(dǎo)致猴B病毒的血清學(xué)檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性[1,5]；普通PCR方法需要結(jié)合限制性酶切或雜交探針等手段，步驟比較繁瑣；有限的qPCR方法則無法檢測猴B病毒所有基因型。

因此鑒于目前檢測方法存在的問題，我們擬建立能同時檢測猴B病毒5種基因型，且與HSV-1、HSV-2無交叉反應(yīng)的猴B病毒通用核酸檢測體系，并對其進(jìn)行方法學(xué)評價。

1 材料與方法

1.1 樣品 HSV-1SM44株的核酸，由中國藥品生物制品檢定所付瑞老師惠贈；HSV-2G株病毒液，由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部感染與免疫學(xué)教研室李爾廣教授惠贈；EB病毒（Epstein barr virus，EBV）陽性定量參考品，購自達(dá)安基因股份有限公司；水痘帶狀皰疹病毒（Varicella zoster virus，VZV）和巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）為本實驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器 高純度病毒核酸提取試劑盒購自Roche公司；Premix ExTaqTM（Probe qPCR）、PremixTaqTM（TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye）、pMD18-T載體和 DNA Marker DL500均購自TaKaRa 公司；CFX96TMreal-time System購自Bio-Rad公司；Gene Quant 1300紫外-可見分光光度計購自GE公司；PCR儀購自Biometra公司。

1.3 猴B病毒通用引物和探針的設(shè)計 GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得猴B病毒gB基因序列有恒河猴猴B病毒（登錄號：AB096160、U14664、AF533768）；食蟹猴猴B病毒（登錄號：KJ566591）；豚尾猴猴B病毒（登錄號：AF226637）；日本獼猴猴B病毒（登錄號：AB087737）；獅尾猴猴B病毒（登錄號：KY628968），利用DNAStar軟件對以上序列進(jìn)行比對分析，確定gB基因相對保守區(qū)域；將猴B病毒gB基因保守區(qū)域序列與HSV-1、HSV-2序列進(jìn)行比對分析，選取特異性較高的區(qū)域作為檢測靶序列。本研究設(shè)計能同時檢測猴B病毒5種基因型的實時熒光定量PCR檢測引物gB-3F、gB-3R及MGB探針gB-3P（上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成），見表1。該擴增片段長度為92 bp。

表1 猴B病毒實時熒光定量PCR檢測引物及探針序列Table 1 The primers and probe sequence of the real-time fl uorescent qPCR assay for detecting Monkey B virus

1.4 猴B病毒通用核酸檢測體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司根據(jù)猴B病毒恒河猴基因型代表株E2490的gB基因序列（nt52137～54815，GenBank登錄號：AF533768）進(jìn)行全基因合成，并插入于PUC19載體，從而獲得含gB基因重組質(zhì)粒。以含gB基因重組質(zhì)粒為模板，使用gB-3F和gB-3R引物進(jìn)行PCR擴增，將回收的目的片段92 bp與pMD18-T載體連接，構(gòu)建得到猴B病毒參考品質(zhì)粒。

以一系列10倍梯度稀釋的猴B病毒參考品質(zhì)粒（3×107～3×102copies）為模板，進(jìn)行qPCR擴增。反應(yīng)體系：Premix ExTaqTM（Probe qPCR）10μL、gB-3F 1 μL、gB-3R 1 μL，gB-3P 800 nmol/μL、MgCl23 mmol/L、模板3 μL、加滅菌ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：先95℃ 30 s；然后95℃ 5 s、58℃ 30 s，共40個循環(huán)。使用Microcal Origin 6.0軟件，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.5 猴B病毒通用核酸檢測體系的特異性評價 使用高純度病毒核酸提取試劑盒提取HSV-2、VZV、EBV、CMV樣本的核酸。分別以猴B病毒參考品質(zhì)粒、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV、CMV核酸為模板，按照1.4所述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行qPCR的特異性實驗，每個樣品設(shè)2個復(fù)孔，同時設(shè)無模板對照（no template control，NTC）。

1.6 猴B病毒通用核酸檢測體系的通用性評價 食蟹猴猴B病毒和恒河猴猴B病毒的擴增靶序列，均與1.4中構(gòu)建的參考品質(zhì)粒的插入片段序列完全一致，因此以猴B病毒參考品質(zhì)粒代表食蟹猴猴B病毒和恒河猴猴B病毒2種基因型。由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司分別根據(jù)豚尾猴猴B病毒（nt54382～54473，GenBank登錄號：KY628970）、日本獼猴猴B病毒（nt1521～1612，GenBank登錄號：AB0887737）和獅尾猴猴B病毒（nt53794～53703，GenBank登錄號：KY628968）代表株相應(yīng)的靶序列采用qPCR擴增全基因序列，得到猴B病毒3種基因型質(zhì)粒。以上述質(zhì)粒為模板，按照1.4所述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行qPCR的通用性實驗，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)NTC。

1.7 猴B病毒通用核酸檢測體系的敏感性評價 分別以一系列10倍梯度稀釋的猴B病毒參考品質(zhì)粒（3×108～3×100copies）作為模板，按照1.4所述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行qPCR的敏感性實驗，同時設(shè)NTC。

1.8 猴B病毒通用核酸檢測體系的重復(fù)性評價 對猴B病毒參考品質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，取5個稀釋度（3×108～3×104copies）參考品質(zhì)粒作為模板，按照1.4所述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)實驗，每個樣品設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)NTC。計算批內(nèi)和批間實驗中各濃度質(zhì)粒的拷貝數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，SD）及其變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），評價猴B病毒核酸檢測體系的重復(fù)性。

2 結(jié)果

2.1 猴B病毒通用核酸檢測體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別以一系列10倍梯度稀釋的猴B病毒參考品質(zhì)粒（3×107～3×102copies）作為模板，按照1.4所述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行 qPCR擴增。由圖1可知，猴B病毒參考品質(zhì)粒在3×107～3×102copies范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（│r│=0.999），標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式：y=42.542-3.209x，擴增效率E=104.9%。

2.2 猴B病毒通用核酸檢測體系的特異性評價 分別以猴B病毒參考品質(zhì)粒、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV、CMV核酸為模板，按照1.4所述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行qPCR擴增。由圖2可知，猴B病毒參考品質(zhì)粒有明顯擴增，HSV-1、HSV-2、VZV、EBV、CMV、NTC均無擴增（熒光信號未達(dá)到閾值）。說明猴B病毒核酸檢測體系具有良好特異性。

2.3 猴B病毒通用核酸檢測體系的通用性評價 分別以猴B病毒日本獼猴、豚尾猴、獅尾猴基因型參考品質(zhì)粒、構(gòu)建的猴B病毒參考品質(zhì)粒（代表食蟹猴、恒河猴基因型）為模板，按照1.4所述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行qPCR的通用性評價。由圖3可知，猴B病毒5種基因型參考品質(zhì)粒均成功擴增，NTC無擴增（熒光信號未達(dá)到閾值），說明建立的猴B病毒核酸檢測體系通用性良好。

2.4 猴B病毒通用核酸檢測體系的敏感性評價 分別以猴B病毒3×108～3×100copies參考品質(zhì)粒為模板，按照1.4所述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行qPCR擴增。由圖4可知，猴B病毒參考品質(zhì)粒為3×100copies時無法檢出，最低可檢測到3×101copies即30 copies，說明建立的該核酸檢測體系具有較好敏感性。

圖1 實時熒光qPCR檢測猴B 病毒的動力學(xué)曲線（A）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）Fig.1 Dynamic curve（A）and standard curve（B）of the real-time fl uorescent qPCR assay for detecting monkey B virus DNA

2.5 猴B病毒通用核酸檢測體系的重復(fù)性評價 分別以猴B病毒3×108～3×104copies濃度的參考品質(zhì)粒為模板，按照1.4所述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行qPCR擴增，并對重復(fù)性實驗結(jié)果進(jìn)行分析。由表2和表3可知，無論批內(nèi)重復(fù)還是批間重復(fù)實驗中，猴B病毒各濃度參考品質(zhì)粒Cq值的標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于0.5，且其變異系數(shù)（CV%）均低于2%。3×104～3×108copies濃度范圍的病毒參考品質(zhì)粒，批內(nèi)重復(fù)實驗中，其拷貝數(shù)的變異系數(shù)（CV%）中位數(shù)為11.26%（7.05%～14.48%）；批間重復(fù)實驗中，變異系數(shù)（CV%）中位數(shù)為10.37%（3.89%～20.21%）。

3 討論

猴B病毒與同屬于皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科、單純皰疹病毒屬的HSV-1和HSV-2具有高度相似性，導(dǎo)致針對猴B病毒的檢測試劑常與HSV-1和HSV-2發(fā)生交叉反應(yīng)，很大程度上影響了猴B病毒的檢測特異性。

圖2 猴B病毒通用核酸檢測體系的特異性Fig.2 Speci fi city of the universal nucletic acid test method for detecting monkey B virus DNA

圖3 猴B病毒通用核酸檢測體系的通用性Fig.3 Universality of the universal nucletic acid test method for detecting monkey B virus DNA

國內(nèi)外已建立了眾多基于普通PCR的猴B病毒檢測方法。1993年，Slomka等[6]采用巢式PCR法擴增猴B病毒US5和US6基因間非編碼區(qū)部分片段，結(jié)合31mer寡核苷酸探針雜交方法對猴B病毒核酸進(jìn)行檢測。2008年，李曉波等[7]分別針對猴B病毒的gG基因和DNA聚合酶亞單位基因設(shè)計了一套引物，以猴B病毒為模板可擴增產(chǎn)生單一目的條帶，而以HSV等病毒為模板進(jìn)行擴增不會獲得產(chǎn)物。然而，現(xiàn)有的普通PCR法都需要對擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，或結(jié)合限制性酶切、雜交探針檢測等手段進(jìn)行特異性鑒定，步驟繁瑣，也增大了污染的幾率。

圖4 猴B病毒通用核酸檢測體系的敏感性Fig.4 Sensitivity of the universal nucletic acid test method for detecting monkey B virus DNA

實時熒光定量PCR法操作簡便且靈敏度高[8]，國外已有少量猴B病毒qPCR檢測方法的報道。2003年，Huff等[9]針對分離自恒河猴的猴B病毒毒株（E2490株）gB基因設(shè)計了引物和探針，建立了猴B病毒qPCR方法，該檢測體系與HVP-2、HSV-2沒有交叉反應(yīng)，但HSV-1是否存在交叉反應(yīng)未進(jìn)行評價。此外，該方法僅評估了其檢測恒河猴、豚尾猴和食蟹猴來源的猴B病毒的能力，對其是否可以有效檢測日本獼猴和獅尾猴來源的猴B病毒未進(jìn)行驗證。同年，Ludmila等[10]針對分離自恒河猴的猴B病毒毒株（E2490株）的gG基因設(shè)計檢測引物和TaqMan探針，建立了與HSV等病毒均無交叉反應(yīng)的特異性猴B病毒qPCR方法。但是該引物探針的設(shè)計未考慮到檢測靶序列的保守性，因此該方法易造成猴B病毒核酸的漏檢，并且該方法僅基于恒河猴猴B病毒一種基因型的核苷酸序列進(jìn)行引物探針的設(shè)計。

表2 猴B病毒通用核酸檢測體系批內(nèi)重復(fù)實驗結(jié)果Table 2 Repeatability of the universal nucletic acid test method for detecting monkey B virus DNA

表3 猴B病毒通用核酸檢測體系批間重復(fù)實驗結(jié)果Table 3 Reproducibility of the universal nucletic acid test method for detecting monkey B virus DNA

關(guān)于猴B病毒的基因型分型問題迄今尚無一致意見，最初有人認(rèn)為存在3種基因型[11]，之后陸續(xù)有文獻(xiàn)分別報道了猴B病毒的第4種和第5種基因型[12,13]，而國內(nèi)有文獻(xiàn)認(rèn)為存在3種基因型[14]，也有文獻(xiàn)認(rèn)為存在4種基因型[15,16]。我們通過對猴B病毒基因型相關(guān)文獻(xiàn)的調(diào)研[11-13,17]，結(jié)合基于猴B病毒gB蛋白（UL27）、UL19蛋白的核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，認(rèn)為猴B病毒應(yīng)分為5種基因型，且基因型與其宿主種系直接相關(guān)，分別為來源于恒河猴、日本獼猴、食蟹猴、豚尾猴和獅尾猴的猴B病毒。在本研究中，我們以猴B病毒相對保守的gB蛋白核苷酸序列作為檢測靶標(biāo)，并通過對猴B病毒5種基因型代表株gB基因進(jìn)行多重比對，進(jìn)一步確定gB基因相對保守區(qū)域。最后，自這些保守區(qū)域中選取特異性較高的序列設(shè)計檢測引物及探針，從而實現(xiàn)特異性檢測5種基因型猴B病毒的目的。本研究建立的檢測體系較之以往報道的qPCR方法具有明顯的通用性優(yōu)勢，方法學(xué)評價結(jié)果顯示，本檢測體系也具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性。

本研究建立的猴B病毒通用核酸檢測體系，對臨床猴B病毒感染病例的確診，以及高質(zhì)量猴群的建立具有重要意義。

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