周圓一，王正祥，汪 亮，徐 帥，曾巧英

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 蘭州 730046）

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一種疾病綜合征，AIV不僅可感染家禽還可以感染人和哺乳動物，在公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義。禽流感病毒屬于正黏病毒科（Orthomyxovirus）A型流感病毒屬，是一種單股負(fù)鏈RNA病毒。根據(jù)血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）的不同，將A型流感病毒分為18種HA亞型以及11種NA亞型[1,2]。

H5N6 AIV于1975年從北美的野鴨群中首次分離出來[3]。在中國，H5N6 AIV于2013年首次出現(xiàn)，近年來在野生水禽和禽類中廣泛流行[4-6]。H5N6亞型禽流感病毒不僅可導(dǎo)致家禽嚴(yán)重發(fā)病，部分病毒還可感染人并引發(fā)嚴(yán)重臨床癥狀和死亡[7]。由此可見，H5N6 AIV對人類乃至整個社會公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅。因此研究H5N6 AIV有重要的意義。

H5N6 AIV基因組由8個基因片段組成，至少編碼12種以上的蛋白，其中NS1是一種非常重要的與病毒毒力密切相關(guān)的調(diào)控蛋白。NS1蛋白在受感染的宿主細(xì)胞中合成，與宿主細(xì)胞內(nèi)多種蛋白分子相互作用，產(chǎn)生復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)，從而調(diào)控病毒的復(fù)制與增殖[8]。

Strep-tag由8個氨基酸組成，該標(biāo)簽通常對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性沒有影響，并且strep-tag標(biāo)簽序列被設(shè)計成以高親和力且可逆地結(jié)合鏈霉親和素，使其能夠高效快捷地分離完整的蛋白質(zhì)復(fù)合物，這將為純化禽流感病毒在感染期間與NS1相互作用的宿主蛋白提供更加高效快捷的途徑[9,10]。

本研究成功構(gòu)建了H5N6 AIV的反向遺傳操作系統(tǒng)，通過序列測定、生長曲線、動物試驗等證明拯救毒株與野生毒株的生物學(xué)特性一致。本研究結(jié)果將為H5N6 AIV的分子致病機理及新型疫苗的研制奠定極其關(guān)鍵的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和實驗動物 H5N6 AIV HN109株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動物病毒分子生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團隊分離并保存；293T細(xì)胞和MDCK細(xì)胞用含5%FBS的DMEM于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；雙向表達(dá)載體pBD由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所陳化蘭研究員饋贈；SPF雞胚購自山東昊泰試驗動物繁育有限公司；6周齡BALB/c雌性小鼠購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；DMEM及胎牛血清購自GIBCO公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Abmart公司；HRP標(biāo)記的Strep抗體購自IBA公司；ExnaseⅡ酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)本實驗室對 H5N6 AIV HN109株的全基因組測序結(jié)果，采用Oligo7.0軟件設(shè)計擴增流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因的引物以及Strep替換引物（表1）。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取及目的片段的擴增 根據(jù)RNeasy Mini Kit（天根生化科技(北京)有限公司）說明書，從感染H5N6 AIV HN109株的SPF雞胚尿囊液中提取總RNA，利用流感病毒通用的12 bp引物反轉(zhuǎn)錄得到病毒cDNA，并以cDNA為模板，用高保真酶擴增病毒的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS8個基因片段。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 經(jīng)過RT-PCR擴增的H5N6 AIV HN109株的8個基因片段進(jìn)行核酸電泳，切取分子量大小相符的片段進(jìn)行膠回收。將pBD線性化載體和純化后的PCR產(chǎn)物通過同源重組法進(jìn)行連接，連接體系（20 μL）：5×CEⅡbuffer 4 μL、pBD線性化載體2 μL、目的片段2 μL、ExnaseⅡ酶2 μL、滅菌ddH2O補足至20 μL。37℃孵育30 min，放冰上5 min。取上述連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞Trans5α中，挑取單菌落接入含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)12 h。小提質(zhì)粒后，將陽性質(zhì)粒送去北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測定，序列正確的陽性質(zhì)粒命名為pBD-NS。

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pBD-NS通過定點突變法對其77～84位的氨基酸進(jìn)行突變，突變引物見表1。以pBD-NS質(zhì)粒為模板，以高保真酶進(jìn)行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系如下（50 μL）：5×PCR buffer 10 μL、dNTP（10 mmol/L）1 μL、引物NSStrep-F和NS-Strep-R（10 μmol/L）各2.5 μL、50 ng模板和1個單位的PCR高保真酶、滅菌ddH2O補足至50 μL。PCR條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，22個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取35 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加入1個單位的DpnⅠ限制性內(nèi)切酶和5 μL 10×Cutsmart buffer，37 ℃酶切1 h，取上述酶切產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞Trans5α中，挑取單菌落接入含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)12 h。小提質(zhì)粒后，將陽性質(zhì)粒送去北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測定。

表1 A/Goose/Hunan/109/2014毒株8個基因片段的擴增引物Table 1 Primers for ampli fi cation of 8 segments of A/Goose/Hunan/109/2014

1.6 病毒拯救及鑒定

1.6.1 病毒拯救與純化 將293T細(xì)胞培養(yǎng)至6孔細(xì)胞板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時開始轉(zhuǎn)染。將構(gòu)建好的質(zhì)粒pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBDHA、pBD-NP、pBD-NA、pBD-M、pBD-NS1-Strep各500 ng加入含有250μL OPTI-MEM中。另將10 μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑加入OPTI-MEM中混勻后室溫靜置5 min。將轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)?；靹蚝笫覝仂o置25 min，加入到用OPTI-MEM清洗2次的6孔細(xì)胞板中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后收取細(xì)胞上清接種到9～11日齡SPF雞胚中。SPF雞胚于37℃繼續(xù)孵化48 h，收集雞胚尿囊液進(jìn)行血凝實驗，將有血凝活性的尿囊液進(jìn)行10倍倍比稀釋，每個稀釋度的病毒液以每枚胚100 μL接種9～11日齡SPF雞胚，48 h后收取尿囊液。進(jìn)行血凝實驗，選取最大稀釋度最高血凝效價尿囊液，按照有限稀釋法稀釋病毒，接種至SPF雞胚純化5代。

1.6.2 拯救病毒的鑒定 從獲救病毒尿囊液中提取RNA，通過RT-PCR擴增獲救病毒的8個基因片段，對其序列測定并與親本病毒序列進(jìn)行比較分析。

1.7 拯救病毒Strep-tag遺傳穩(wěn)定性鑒定 通過SPF雞胚純化第5代的HN109病毒尿囊液（HN109-F5）、rHN109-NS1-Strep第1代（rHN109-NS1-Strep-F1）、第3代（rHN109-NS1-Strep-F3）和第5代（rHN109-NS1-Strep-F5）的病毒尿囊液感染MDCK細(xì)胞，24 h后收集蛋白樣品。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析后，轉(zhuǎn)移到NC膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，將稀釋后的一抗與NC膜室溫孵育1 h，用TBST緩沖液洗滌3次。將稀釋后的二抗與NC膜室溫孵育1 h，用TBST洗滌后加入顯色液，暗室曝光。

1.8 病毒的生長曲線 分別以0.01 MOI和2 MOI的病毒量將病毒株HN109和rHN09-NS1-Strep接種到培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的12孔細(xì)胞板中，按照時間點收集細(xì)胞上清，每個時間點做3次重復(fù)。將收集的細(xì)胞上清用滅菌的PBS進(jìn)行10倍的倍比稀釋，然后接種至9～11日齡雞胚，每個稀釋度接種3枚雞胚，每枚100 μL，測定病毒滴度，利用GraphPad Prism 6軟件繪制生長曲線。

1.9 小鼠的感染性試驗 將病毒稀釋至106EID50/50 μL并置于冰盒中，將6周齡BALB/c雌性小鼠用干冰麻醉，吸取50 μL病毒液，通過鼻腔感染干冰麻醉的小鼠。感染第5 d后安樂死3只小鼠，采集腦、鼻夾、肺臟、腎臟、脾臟組織，測定臟器中的病毒含量。其余小鼠感染后每天稱體重，直至感染后第14 d對其安樂致死。

2 結(jié)果

2.1 H5N6 AIV HN109株各基因片段的擴增 通過RTPCR擴增了H5N6 AIV HN109株的8個基因片段。經(jīng)核酸電泳鑒定，獲得與目的片段大小相等的8個基因片段：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS（圖1），擴增的8個基因片段通過同源重組法分別連接到pBD載體，將測序正確的陽性質(zhì)粒擴大培養(yǎng)，并將NS1質(zhì)粒的77～84位氨基酸成功替換為Strep-tag。

2.2 病毒拯救與鑒定 將構(gòu)建好的質(zhì)粒pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-HA、pBD-NP、pBDNA、pBD-M和pBD-NS1-Strep共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，成功拯救重組病毒，命名為rHN109-NS1-Strep，獲救病毒血凝效價可達(dá)到28。

對獲救病毒rHN109-NS1-Strep各基因片段進(jìn)行RT-PCR擴增并測序，序列比對結(jié)果表明PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M基因與野生病毒HN109株序列一致，NS1-Strep基因片段與其設(shè)計基因序列一致。表明攜帶Strep-tag的NS1基因片段已成功構(gòu)建，并能與其他7個片段重組獲得拯救病毒rHN109-NS1-Strep。

圖1 H5N6 AIV HN109株8個基因片段RT-PCR擴增Fig.1 Ampli fi cation of eight gene segments from H5N6 AIV HN109 strain by RT-PCR

2.3 拯救病毒Strep-tag的遺傳穩(wěn)定性鑒定 將SPF雞胚純化第5代的HN109病毒尿囊液以及rHN109-NS1-Strep第1代、第3代和第5代的病毒尿囊液感染MDCK細(xì)胞后，24 h后收集蛋白樣品進(jìn)行Western blot。結(jié)果顯示，在第1、第3、第5代rHN109-NS1-Strep病毒中Strep標(biāo)簽都穩(wěn)定存在于NS1蛋白中，見圖2。表明Strep標(biāo)簽穩(wěn)定存在于rHN109-NS1-Strep中。

圖2 Western blot鑒定Strep-tag遺傳穩(wěn)定性Fig.2 Identi fi cation of genetic stability of Strep-tag by Western blot

2.4 病毒的生長 曲線分別以0.01 MOI和2 MOI的病毒量將H5N6 AIV HN109株和rHN09-NS1-Strep株接種到培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的12孔細(xì)胞板中，收集不同時間點細(xì)胞上清，測定病毒在MDCK細(xì)胞中的增殖情況，見圖3。結(jié)果顯示，H5N6 AIV HN109與拯救毒株rHN109-NS1-Strep復(fù)制能力基本相似，一步生長曲線中野生病毒HN109株與拯救病毒rHN109-NS1-Strep株在最高滴度都接近106EID50/mL，多步生長曲線中野生毒株HN109與拯救毒株rHN109-NS1-Strep最高滴度都接近106.5EID50/mL，因此，野生病毒HN109株與拯救病毒rHN109-NS1-Strep株在MDCK細(xì)胞上的復(fù)制能力并無顯著性差異。

圖3 野生毒株H5N6 AIV HN109與拯救毒株在MDCK細(xì)胞的一步生長曲線（A）和多步生長曲線（B）Fig.3 Single cycle growth curves（A） and multi-cycle growth curves （B）of wild-type strain and rescued strainin MDCK cells

2.5 小鼠致病性試驗 以106EID50/50μL病毒量鼻腔接種小鼠后，HN109在與rHN109-NS1-Strep株均可引起小鼠體重緩慢上升，但小鼠未出現(xiàn)死亡，也沒有表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀（圖4）。病毒感染小鼠5 d后，對小鼠實行安樂死，采集肺臟、鼻甲、腦、脾臟和腎臟，對其病毒含量進(jìn)行滴定。結(jié)果顯示，H5N6 AIV HN109株與rHN109-NS1-Strep株均可在肺臟和鼻甲中有效復(fù)制，且復(fù)制能力相似。但在小鼠的腦、脾臟、腎臟中檢測不到病毒的復(fù)制（圖4）。

圖4 小鼠感染H5N6 AIV HN109，rHN109-NS1-Strep毒株后體重變化（A）和各組織臟器病毒滴度（B）Fig.4 The body weight change（A） and virus titer in organs （B）of mice after intranasal inoculation with 106 EID50 dose of HN109 and rHN109-NS1-Strep strains

3 討論

NS1蛋白是A型流感病毒重要的毒力因子，可以通過多種方式與宿主細(xì)胞功能分子相互作用[11,12]。NS1可以抑制細(xì)胞凋亡，從而保證病毒能夠充分地生長復(fù)制[13]；流感病毒感染后，NS1蛋白可以破壞細(xì)胞核內(nèi)宿主mRNA前體3'端的正常加工，使其不能由細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)中[4,15]；NS1蛋白還可阻礙干擾素的產(chǎn)生并拮抗其對流感病毒的殺傷作用[16]等。

有研究表明，NS1蛋白的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)結(jié)構(gòu)連接區(qū)的氨基酸殘基D74-L77和K79-R83是高度可變的[17]。并且關(guān)于NS1的X射線結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，對應(yīng)于75～79氨基酸殘基的區(qū)域未明確定義，說明連接區(qū)在本質(zhì)上具有高度靈活性[18]，適于修飾。有研究報道表明，對NS1蛋白77～84位氨基酸引入Strep-tag序列，并不影響病毒的生物學(xué)特性[19]。因此我們對NS1蛋白第77～84氨基酸位置特異性的引入Strep-tag序列，并拯救出帶有Strep-tag的重組毒株rHN109-NS1-Strep。病毒一步生長曲線和多步生長曲線表明野生病毒H5N6 AIV HN109株與拯救病毒rHN109-NS1-Strep株在MDCK細(xì)胞上的復(fù)制能力并無顯著性差異。在研究病毒對小鼠的致病性實驗中，野生病毒H5N6 AIV HN109株與拯救病毒rHN109-NS1-Strep株均可在小鼠呼吸道內(nèi)復(fù)制，但是小鼠并未表現(xiàn)出明顯的體重下降，也不對小鼠致死，這是因為沒有檢測到野生病毒H5N6 AIV HN109株與拯救病毒rHN109-NS1-Strep株在小鼠大腦中復(fù)制，而之前研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒能夠進(jìn)入大腦并在大腦復(fù)制，可能是其對小鼠呈現(xiàn)高致病性并致死的原因[20]。這些結(jié)果表明Strep標(biāo)簽的插入并不影響病毒的生物學(xué)特性。

所有這些結(jié)果表明，本研究所建立的H5N6 AIV的反向遺傳操作系統(tǒng)為進(jìn)一步研究病毒復(fù)制機制及致病機理提供研究平臺，同時為H5N6 AIV新型疫苗的研制開辟了新的方向。

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