肖 琦 ，茅愛華 ，汪 偉 ，俞正玉 ，郭佳慧 ,2，袁萬(wàn)哲 ，趙攀登 ，溫立斌 ，范寶超 ，李 彬 ，朱雪蛟，胡屹屹，郭容利，曲 夢(mèng),5，楊 倩，何孔旺

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210014；2. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州225009；3. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定071001；4. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州450046；5.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，林芝860000；6. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京210095）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是一種環(huán)形單鏈DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬成員[1]，已知的豬圓環(huán)病毒（PCV）包括豬圓環(huán)病毒1型（Porcine circovirus type 1，PCV1）和豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）。PCV1最初被認(rèn)為是PK-15細(xì)胞培養(yǎng)物的污染物，對(duì)豬是非致病性的[2]；與PCV1不同，豬感染PCV2可引起豬圓環(huán)病毒?。≒orcine circovirus disease，PCVD）或稱豬圓環(huán)病毒相關(guān)疫?。≒orcine circovirus associated disease，PCVAD），臨床表現(xiàn)主要有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、繁殖障礙、豬皮炎腎病綜合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、先天性震顫（Congenital tremors，CT）、豬呼吸道疾病綜合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）、腸炎、增生性和壞死性肺炎（Proliferative and necrotizing pneumonia，PNP）等，該病呈全球分布，自20世紀(jì)末爆發(fā)以來(lái)，已給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。2015年6月，美國(guó)北卡羅來(lái)納州一個(gè)商品豬場(chǎng)的母豬爆發(fā)豬皮炎腎病綜合征（PDNS）和繁殖障礙，應(yīng)用宏基因組測(cè)序和PCR沒有檢測(cè)到PCV2、PRRSV等已知病毒，但發(fā)現(xiàn)了一種基因組長(zhǎng)度為2000 bp新的環(huán)狀DNA病毒，被命名為PCV3[4]。Palinski等[4]應(yīng)用熒光定量PCR從具有PDNS癥狀母豬的流產(chǎn)胎兒中檢出高拷貝的PCV3。Phan等[5]在心臟和多種全身炎癥的豬中也檢測(cè)到了PCV3?；厮菪粤餍胁W(xué)調(diào)查結(jié)果表明，PCV3于2010～2016年間已經(jīng)在美國(guó)豬場(chǎng)普遍存在[4,5]。2017年，Ku等[6]首先報(bào)道在中國(guó)豬群中也存在PCV3感染，在所檢測(cè)的遼寧省、江西省等10個(gè)省市樣品中均可檢測(cè)到PCV3。本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種快速、特異、靈敏度高的PCV3 PCR檢測(cè)方法，并利用該方法對(duì)2014～2017年收集的臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，以了解江蘇省豬群PCV3的感染情況。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）為本實(shí)驗(yàn)室保存毒株。

1.1.2 臨床樣品 共1438份樣品，采自江蘇省2014～2017年267個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)，其中發(fā)病豬組織樣品938份、健康豬組織樣品500份。-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑 TIANDZ柱式病毒DNAout試劑盒購(gòu)自北京天恩澤公司；普通2×mix、2000 bp DNA Marker購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；金牌Mix（green）購(gòu)自南京擎科生物科技有限公司；瓊脂糖購(gòu)自臺(tái)灣生工生物工程服務(wù)有限公司；pMD19-T載體購(gòu)自寶生生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 運(yùn)用的Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)GenBank中已登錄的PCV3全基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物PA2F和PA2R，擴(kuò)增目的片段預(yù)期大小為932 bp。PA2F：5'-CAGCTGTGG GCCTCCTAATGAAT-3'；PA2R：5'-CCCCCGT GGCTTGAAATACAG-3'。引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.2 臨床樣品處理及核酸提取 稱量25.0 mg病料組織，放入破碎管中，加入1.0 mL濃度為0.01 mol/L的無(wú)菌PBS（pH7.2）及3顆鋼珠，在均質(zhì)破碎儀上破碎2～3次，反復(fù)凍融3次，4℃ 8000×g離心2 min，收集上清，用TIANDZ 柱式病毒DNAout試劑盒，按說(shuō)明書的方法提取樣品DNA模板。

1.2.3 PCV3陽(yáng)性質(zhì)粒的制備 以1.2.2提取的樣品DNA為模板，用引物PA2F和PA2R進(jìn)行PCR反應(yīng)，將大小為923 bp的目的片段切膠回收，連接pMD19-T載體進(jìn)行TA克隆，構(gòu)建pMD19-PCV3重組質(zhì)粒，送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序鑒定。將鑒定含有PCV3目的片段的質(zhì)粒作為PCV3陽(yáng)性質(zhì)粒。

1.2.4 PCR的建立及條件優(yōu)化 分別設(shè)定退火溫度（51.5℃～64.5℃）、延伸時(shí)間（60 s～75 s）、引物量（0.5 μL～1 μL)、模板量（1 μL～3 μL）幾個(gè)變量，對(duì)PCR檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳反應(yīng)條件。

1.2.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序鑒定 選取經(jīng)1.2.3建立的PCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性的部分樣品，將PCR產(chǎn)物切膠回收，TA克隆后，送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAStar軟件與GenBank中登錄的PCV3基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定PCR擴(kuò)增片段的特異性。

1.2.6 PCR特異性試驗(yàn) 用1.2.3建立的PCR方法分別擴(kuò)增PCV1、PCV2、CSFV、PRRSV、PRV和PPV，并以PCV3陽(yáng)性質(zhì)粒和ddH2O依次作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，檢測(cè)該P(yáng)CR方法的特異性。

1.2.7 PCR敏感性試驗(yàn) 測(cè)PCV3陽(yáng)性質(zhì)粒的濃度，并依次做10倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度取1μL作為PCR反應(yīng)模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)定最低檢出濃度，評(píng)估該P(yáng)CR方法的敏感性。

1.2.8 臨床樣品PCR檢測(cè) 利用建立的PCR方法對(duì)2014～2017年本研究室收集的臨床發(fā)病豬樣品及健康豬樣品共1438份進(jìn)行回顧性檢測(cè)，分析不同年份豬場(chǎng)及樣品中的PCV3的感染情況。

2 結(jié)果

2.1 PCV3陽(yáng)性質(zhì)粒的制備 用引物PA2F和PA2R對(duì)病料DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到與預(yù)期相符的932 bp的目的條帶（圖1）。經(jīng)切膠回收TA克隆后，將pMD19-PCV3重組質(zhì)粒送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI公布的PCV3/CN/Hubei-618毒株的同源性達(dá)到99.8%，說(shuō)明構(gòu)建的PCV3陽(yáng)性質(zhì)粒正確。

圖1 PCV3 PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR ampli fi cation of PCV3 genome

2.2 PCR反應(yīng)的建立及條件優(yōu)化 經(jīng)條件優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系為25.0 μL：上游引物1.0μL，下游引物1.0 μL，模板1.0 μL，2×mix 12.5 μL，無(wú)菌ddH2O 9.5 μL；最佳反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、53.6℃退火30 s、72℃延伸65 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。

2.3 PCR特異性試驗(yàn) 利用建立的最優(yōu)PCR反應(yīng)條件，對(duì)PCV1、PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PPV進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，建立的PCR方法只能擴(kuò)增出PCV3樣品中的特異性目的片段，而對(duì)PCV1、PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PPV均擴(kuò)增不出目的片段。雖然PRV出現(xiàn)非特異性目的條帶，但大小低于500 bp，而且比較弱，不影響PCV3的結(jié)果判定（圖2）。表明該P(yáng)CR方法特異性較好。

2.4 PCR敏感性試驗(yàn) 用建立的最優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，對(duì)不同稀釋度的PCV3陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，用普通2×mix可檢測(cè)到的最低質(zhì)粒濃度為10 copy/μL；用金牌Mix（green），偶可檢測(cè)到1 copy/μL（圖3）。表明該方法具有較好的敏感性。

圖2 PCR特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Speci fi city test of PCR

2.5 臨床樣品PCR檢測(cè)及序列分析 在938份臨床發(fā)病豬樣品中，檢出PCV3陽(yáng)性樣品65份，陽(yáng)性檢出率為6.93%；500份健康豬樣品僅檢出3份PCV3陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為0.6%，臨床發(fā)病豬樣品中PCV3的檢出率明顯高于健康豬。從年份上看，2014年的病料中PCV3的陽(yáng)性檢出率為1.92%，2015年為3.08%，2016年為5.26%，2017年為12.67%（表1）。在樣品來(lái)源的267個(gè)豬場(chǎng)中，檢出PCV3陽(yáng)性豬場(chǎng)35個(gè)，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為13.11%。2014年和2015年豬場(chǎng)陽(yáng)性率較低，分別為4.55%和5.13%；2016年升高到12.09%；2017年達(dá)到25.00%（表2）。16份PCV3陽(yáng)性樣品的PCR擴(kuò)增序列與PCV3/US/SD2016株的同源性為98.4%～99.6%，與PCV3/CN/Hubei-618株的同源性為99.0%～99.8%，16株病毒之間的同源性為98.3%～100%（表3）。

表1 2014～2017年病豬臨床樣品PCV3檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 1 PCV3 test statistics of diseased pig clinical samples from 2014 to 2017

表2 2014～2017年豬場(chǎng)PCV3陽(yáng)性統(tǒng)計(jì)表Table 2 PCV3 positive rate of pig farms from 2014 to 2017

3 討論

本研究建立了檢測(cè)PCV3的PCR方法。經(jīng)臨床樣品檢測(cè)，證明該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好，可以作為一種操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉的檢測(cè)方法，從而得以推廣應(yīng)用。在試驗(yàn)過程中，我們比較了多對(duì)引物（包括已報(bào)道的引物[4]），PCR結(jié)果顯示，本方法中所使用的引物擴(kuò)增效率高，陽(yáng)性條帶更清晰，且雜帶少，更適用于臨床樣品中PCV3的核酸檢測(cè)。本方法用普通2×mix可檢測(cè)到的最低質(zhì)粒濃度達(dá)到10 copy/μL，而用金牌Mix（green）甚至偶可檢測(cè)到1 copy/μL，高于徐朋麗等[7]報(bào)道的方

法。PCR特異性試驗(yàn)中，對(duì)PCV1、PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PPV均擴(kuò)增不出目的片段，而PRV會(huì)出現(xiàn)較弱的大小約為350 bp的非特異性條帶，但由于其大小明顯小于PCV3擴(kuò)增片段，不會(huì)干擾PCV3的結(jié)果判定。

表3 16份PCV3陽(yáng)性樣品的PCR擴(kuò)增序列同源性比較Table 3 Comparison of amplif i cation sequences of 16 PCV3 positive samples

江蘇省2014～2017年的臨床發(fā)病豬及健康豬樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，病豬（PMWS/PRDC/腹瀉）PCV3的檢出率明顯高于健康豬，表明PCV3可能與這些疫病的發(fā)生有一定的關(guān)系。從時(shí)間上看，2014年，江蘇豬群中PCV3豬場(chǎng)陽(yáng)性率和樣品陽(yáng)性率分別只有4.55%和1.92%，其后，陽(yáng)性率逐年遞增，至2017年分別達(dá)到25.00%和12.67%。該結(jié)果與Wang等[8]的報(bào)道基本一致。PCV3的這種流行趨勢(shì)值得高度重視。

Fan等[9]和Shen等[10]分別對(duì)中國(guó)PCV3毒株的全長(zhǎng)序列與PCV3/US/SD2016株進(jìn)行了同源性分析，結(jié)果顯示中國(guó)PCV3/CN/Hubei-618、PCV3/China/GD2016毒株與PCV3/US/SD2016株的同源性分別為99.1%～99.6%和97.4%～98.5%。本研究對(duì)16個(gè)樣品的PCV3擴(kuò)增片段進(jìn)行了序列測(cè)定，同源性比較結(jié)果顯示，所測(cè)各毒株之間的核苷酸序列同源性為98.3%～100%；與PCV3/US/SD2016株的同源性為98.4%～99.6%；與PCV3/CN/Hubei-618株的同源性為99.0%～99.8%。不同年份的毒株之間的同源性差異無(wú)明顯規(guī)律性。表明PCV3毒株之間存在一定的變異，但其變異與地域及年份并無(wú)直接關(guān)系。

參考文獻(xiàn)

[1] Mankertz A, Caliskan R, Hattermann K,et al. Molecular biology of Porcine circovirus： analyses of gene expression and viral replication[J]. Vet Microbiol, 2004, 98(2)： 81-88.

[2] Tischer I, Rasch R, Tochtermann G. Characterizati on of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines[J]. Zentralbl Bakteriol Orig A, 1974,226(2)： 153-167.

[3] Opriessnig T, Meng X J, Halbur P G. Porcine circovirus type 2 associated disease： update on current terminology,clinical manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies[J]. J Vet Diagn Invest, 2007, 19(6)：591-615.

[4] Palinski R, Pi?eyro P, Shang P,et al. A Novel Porcine Circovirus Distantly Related to Known Circoviruses Is Associated with Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome and Reproductive Failure[J]. J Virol, 2016,91(1). pii： e01879-16.

[5] Phan T G, Giannitti F, Rossow S,et al. Detection of a novel circovirus PCV3 in pigs with cardiac and multisystemic inflammation[J]. Virol J, 2016, 13(1)：184.

[6] Ku X, Chen F, Li P,et al. Identification and genetic characterization of porcine circovirus type 3 in China[J].Transbound Emerg Dis, 2017, 64(3)： 703-708.

[7] 徐朋麗, 張鴻鑫, 張宇, 等. 豬圓環(huán)病毒3型PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2017, 39(9)： 727-730.

[8] Wang J, Zhang Y, Wang J,et al. Development of a TaqMan-based real-time PCR assay for the specific detection of porcine circovirsu 3[J]. J Virol Methods,2017, 248：177-180.

[9] Fan S, Ku X, Chen F,et al. Complete genome sequence of a novel porcine circovirus type 3 strain, PCV3/CN/Hubei-618/2016, isolated from China[J]. Genome Announc, 2017, 13, 5(15). pii： e00100-17.

[10] Shen H, Liu X, Zhang P,et al. Genome characterization of a porcine circovirus type 3 in South China[J].Transbound Emerg Dis, 2018, 65(1)： 264-266.