張登祿 杜梟航 孔峰 趙升田2,

多能干細(xì)胞（pluripotent stem cell，PSC）主要包括胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）等。隨著人們對(duì)干細(xì)胞特性認(rèn)識(shí)的提高，干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越大的作用。在世界范圍內(nèi)慢性腎病發(fā)病率高達(dá)10﹪，日益成為一個(gè)嚴(yán)重的公眾健康問(wèn)題[1]。臨床中，慢性腎病診斷為腎小球腎炎、隱匿性腎炎、腎盂腎炎、過(guò)敏性紫癜腎炎、紅斑狼瘡腎炎、痛風(fēng)腎、腎病綜合征、膜性腎病、腎病綜合征和糖尿病腎病等等。慢性腎病如未能及時(shí)有效救治，導(dǎo)致病情惡化進(jìn)展，則隨病程遷延，慢性腎病患者將發(fā)展成為慢性腎功能不全、腎衰竭，最終形成尿毒癥，嚴(yán)重威脅患者生命。慢性腎病的病理過(guò)程是一個(gè)漸進(jìn)的、不可逆的腎單位損失，而腎單位是維持腎臟功能的基本單位。因此，腎單位再生研究具有重要的研究意義及臨床價(jià)值。近年來(lái)，PSC體外誘導(dǎo)分化產(chǎn)生功能性的腎單位方法越來(lái)越成熟[2-4]。其中腎臟類器官的出現(xiàn)是腎臟再生領(lǐng)域中一個(gè)突破性的進(jìn)展。2015年來(lái)自澳大利亞和美國(guó)的科研團(tuán)隊(duì)分別于10月份和12月份在Nature雜志發(fā)表腎臟類器官的體外培育的方法與結(jié)果[3-4]。兩種方法培育出的腎臟類器官均具備腎單位的基本結(jié)構(gòu)腎小管、腎小球、集合管，具有重要的應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值。

一、腎臟發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)

在發(fā)育生物學(xué)上，哺乳動(dòng)物腎臟來(lái)源于中間中胚層（intermediate mesoderm，IM）。細(xì)胞從原始體節(jié)中胚層（primitive streak mesoderm，PSM）分化形成IM。IM分化產(chǎn)生兩種關(guān)鍵的腎臟祖細(xì)胞（nephric progenitor cell，NPC）群體，即輸尿管芽（ureteric bud，UB）和后腎間質(zhì)（metanephric mesenchy，MM），分別形成集合管和腎單位。像許多器官一樣，腎臟的發(fā)育涉及不同細(xì)胞之間相互誘導(dǎo)、自我組裝形成最終的腎臟結(jié)構(gòu)。在哺乳動(dòng)物腎臟發(fā)育中，三對(duì)排泄器官（前腎、中腎、后腎）由頭至尾依次排列。其中只有后腎成為出生后動(dòng)物的永久性器官。后腎發(fā)育起始于MM產(chǎn)生膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)UB（腎管的分支）產(chǎn)生[5]。UB成長(zhǎng)為間充質(zhì)，然后通過(guò)二叉分支形成腎臟集合管。這種上皮分支的延長(zhǎng)需要周圍間質(zhì)分泌膠質(zhì)細(xì)胞源性生長(zhǎng)因子，同時(shí)間質(zhì)需要來(lái)自UB的信號(hào)。與UB關(guān)系最為密切的間質(zhì)是帽間質(zhì)（capmesenchyme）。這一細(xì)胞群體需要來(lái)自頂端的信號(hào)進(jìn)行增殖與自我更新，同時(shí)也可以分化成具有濾過(guò)功能的腎單位。經(jīng)典的Wnt信號(hào)可以誘導(dǎo)帽間質(zhì)經(jīng)過(guò)間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化產(chǎn)生腎單位[6-7]，而 FGF（FGF9，F(xiàn)GF20）、BMP（Bmp7 信號(hào)通過(guò)JNK）、低水平的Wnt信號(hào)及來(lái)自周圍間質(zhì)的信號(hào)是帽間質(zhì)維持和增殖所必需的。因此，器官的發(fā)育過(guò)程是生態(tài)空間內(nèi)自我組裝過(guò)程。

二、PSC誘導(dǎo)分化成腎臟類器官的方法與分子機(jī)制

基于上述腎臟胚胎發(fā)育的機(jī)理，許多實(shí)驗(yàn)室最近報(bào)道了體外誘導(dǎo)人PSC生成腎臟類器官的方法[2-4]。

（一）基本方法

腎臟類器官的形成分為3個(gè)主要階段。干細(xì)胞首先分化成PSM，進(jìn)一步分化成IM，IM再分化成MM和UB。第一階段：干細(xì)胞分化成PSM。PSM是中胚層和內(nèi)胚層的祖細(xì)胞群，可以由小鼠ESC經(jīng)過(guò)激活素A（activin A）與BMP4誘導(dǎo)而成[8]，其中activin A決定了內(nèi)胚層向前體節(jié)中胚層分化而中胚層向后PSM分化[9]。在小鼠和人的ESC分化過(guò)程中，經(jīng)典的Wnt信號(hào)也可以作為PSM的誘導(dǎo)劑[10]。

第二階段：PSM分化成IM。原腸胚形成后，中胚層進(jìn)一步產(chǎn)生IM、傍軸中胚層（paraxial mesoderm，PM）和側(cè)板中胚層（lateral plate mesoderm，LPM）。過(guò)去的研究認(rèn)為轉(zhuǎn)錄因子OSR1是IM甚至MM形成的標(biāo)志[11]，最近研究發(fā)現(xiàn)OSR1在軀體中胚層延伸至LPM[12]。PSM經(jīng)BMP4/activin A，誘導(dǎo)后3 d會(huì)有OSR1的表達(dá)，而IM其他標(biāo)志物，比如PAX2和LHX1并無(wú)表達(dá)[12-13]，這一結(jié)果提示第二階段分化需要新的生長(zhǎng)因子的參與，F(xiàn)GF信號(hào)也可能參與該過(guò)程，F(xiàn)GF8從PSM至后軀干中胚層階段均有表達(dá)，而FGF9在IM和PM中有表達(dá)[14-15]。在體外MM的生存需要培養(yǎng)基中加入FGF2/BMP7或FGF9。在FGF2或FGF9因子的刺激下，OSR1、PAX2和LHX1共同表達(dá)，其中PAX2的表達(dá)率超過(guò)80﹪，這些都是IM的分化特征[16]。FGF9誘導(dǎo)IM產(chǎn)生是濃度依賴性的(最佳濃度為200 ng/ml）抑制LPM的分子標(biāo)志FOXF1和OSR1的表達(dá)[16]。因此，F(xiàn)GF信號(hào)可以有效并特異性地誘導(dǎo)PSM分化成IM。

第三階段：IM分化成MM和UB。在哺乳動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中，IM分化成腎臟、性腺和腎上腺，腎管是首先形成的結(jié)構(gòu)，沿著腎管從頭至尾依次排列著三對(duì)排泄器官（前腎、中腎、后腎），他們均發(fā)源于同一腎源性脊髓，只有后腎一直保留，并且成為動(dòng)物永久性器官，后腎形成的關(guān)鍵是重要細(xì)胞組分之間相關(guān)誘導(dǎo)作用。MM通過(guò)表達(dá)GDNF促進(jìn)UB生成，UB通過(guò)表達(dá)FGF9為MM的生存提供了必要條件，通過(guò)Wnt信號(hào)通路誘導(dǎo)腎單位的形成，每個(gè)腎單位延長(zhǎng)或分段形成許多不同功能的細(xì)胞類型。研究證實(shí)維甲酸（retinoid acid，RA）具有促進(jìn)UB生長(zhǎng)的功能[17]，RA和BMP7能夠誘導(dǎo)小鼠ESC向腎系分化[18]，而FGF9可以維持小鼠腎單位祖細(xì)胞的狀態(tài)[19]。利用BMP4/activin A誘導(dǎo)人體胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESC）分化后，從第6天至第17天加入200 ng/ml FGF9、50 ng/ml BMP7和0.1 μmol/L RA。整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程利用RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：hESC逐漸從PSM中胚層（MIXL1，LHX1）經(jīng)IM（OSR1、PAX2、LHX1）分 化 成 MM（SIX2、WT1、GDNF、HOXD11）[16]。HOXD11的表達(dá)提示了后腎的出現(xiàn)，重要的是，腎管（輸尿管）上皮基因（C-RET、HOXB7）也同時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)，在誘導(dǎo)程序的第14天，ECAD+PAX2+上皮結(jié)構(gòu)就已經(jīng)出現(xiàn)，RA以濃度依賴的作用方式對(duì)這些早期上皮結(jié)構(gòu)的形成起了促進(jìn)作用，這些上皮結(jié)構(gòu)和周圍間質(zhì)被證明有增殖的作用。在腎臟發(fā)育過(guò)程中，陽(yáng)性表達(dá)SIX2和WT1的初始間質(zhì)區(qū)被ECAD+輸尿管上皮所包圍，WT1+細(xì)胞的百分比在輸尿管上皮出現(xiàn)后繼續(xù)增加，提示W(wǎng)T1在腎單位祖細(xì)胞和分化更好的腎結(jié)構(gòu)中均有表達(dá)，在誘導(dǎo)分化的第22天，足細(xì)胞標(biāo)志基因（SYNPO、NPHS1和WT1）、腎小管標(biāo)志基因（AQP1和SLC3A1）和集合管標(biāo)志基因（AQP2和SCNNB1）都有明顯表達(dá)[16]。

另外利用CHIR99021起始誘導(dǎo)程序，加入RA/FGF9可產(chǎn)生大量的輸尿管上皮，但其周圍的PAX2+MM細(xì)胞變得稀疏，相反，單獨(dú)延長(zhǎng)FGF9誘導(dǎo)分化，同樣可以逐步誘導(dǎo)PSM、IM至MM/UB的分化，此方法可以更快地誘導(dǎo)干細(xì)胞表達(dá)腎臟標(biāo)志物，MM基因比如SIX2表達(dá)持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)[16]。另外一個(gè)輸尿管上皮標(biāo)志分子GATA3與PAX2共表達(dá)于輸尿管上皮，更重要的是，輸尿管上皮周圍的MM更致密，更接近發(fā)育的腎臟，在這種方法中，PAX2在間質(zhì)和輸尿管上皮均有表達(dá)，在WT1+和WT-的細(xì)胞中均有HOXD11蛋白分子的表達(dá)，這一結(jié)果提示MM的存在。

（二）腎臟發(fā)育中不同細(xì)胞群的自我組裝過(guò)程

在腎臟發(fā)育中形成了許多不同類型的細(xì)胞群，這些細(xì)胞群通過(guò)彼此間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)形成自我組裝的組織。Takasato等[16]利用CHIR99021-FGF9誘導(dǎo)程序?qū)ESC進(jìn)行了誘導(dǎo)培養(yǎng)，在第12 ～ 18天撤掉生長(zhǎng)因子，到第18天伸長(zhǎng)的ECAD+輸尿管上皮被幾簇間質(zhì)（表達(dá)MM分子標(biāo)志，WT1、SIX2和PAX2）所包圍，這種MM的形成看上去像腎單位（腎小囊），表達(dá)JAG1和CDH6蛋白，此外，連接輸尿管上皮與腎小囊腔體在腎單位成熟過(guò)程中出現(xiàn)。

腎單位形成是一個(gè)復(fù)雜的分段、形態(tài)改變和分化的過(guò)程。重聚實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠胚腎分離成單細(xì)胞可以與不分化和分化12 d的hESC形成聚集，以聚集體形式培養(yǎng)4 d后，進(jìn)行分割鑒定。hESC源的細(xì)胞誘導(dǎo)分化成腎臟發(fā)育的主要組分，包括PAX2+CALB+輸尿管上皮、CDH6+JAG1+早期腎囊、SIX2+WT1+NPC間質(zhì)，而hESC源的細(xì)胞經(jīng)BMP4/activin A-FGF9/BMP7/RA誘導(dǎo)只能分化成MM和UB[16]，這種細(xì)胞聚集在未分化的hESC細(xì)胞之間并不發(fā)生。

分離胚胎腎臟體外培養(yǎng)可以長(zhǎng)成類器官：在周圍輸尿管上皮的刺激下分支產(chǎn)生輸尿管上皮并經(jīng)歷腎單位的形成、形態(tài)改變和分段。hESC以單層細(xì)胞形式進(jìn)行分化，可以用于研究不良環(huán)境對(duì)自我組裝和形態(tài)變化的影響，在IM形成之后，將細(xì)胞消化分散以不同的密度重新接種繼續(xù)培養(yǎng)，按CHIR99021-FGF9程序進(jìn)行至第18天，以高密度接種的形成均勻的單層，而那些低密度接種產(chǎn)生許多小的、半球形的類器官分散于平板上。在上述兩種情況下，WT1+MM和ECAD+UB均有分布，而體積較小的半圓形克隆形成緊密組裝、更高級(jí)的結(jié)構(gòu)，這一結(jié)果說(shuō)明3D環(huán)境能夠增強(qiáng)自我組裝。

如果腎臟形態(tài)發(fā)生所需的細(xì)胞群都存在，培養(yǎng)hESC向腎臟方向誘導(dǎo)，應(yīng)該可以形成腎臟類器官，不要其他支持細(xì)胞的參與。hESC分化培養(yǎng)至第18天后進(jìn)行消化分離，離心形成細(xì)胞團(tuán)塊，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，組織分析發(fā)現(xiàn)ECAD+小管存在輸尿管上皮分子標(biāo)志PAX2、AQP2，或近端小管的分子標(biāo)志AQP1和SLC3A19。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，WT1+PAX2+MM存在于ECAD+輸尿管上皮周圍，這提示JAG1+ECAD+腎小囊形成，hESC通過(guò)培養(yǎng)分化形成的結(jié)構(gòu)與正常小鼠胚胎腎臟通過(guò)分離、重聚形成的結(jié)構(gòu)并沒(méi)有不同，通過(guò)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)證實(shí)83﹪（5/6）的細(xì)胞團(tuán)塊具有自我組裝能力[16]。

在發(fā)育過(guò)程和損失修復(fù)過(guò)程中細(xì)胞均具有自我組裝的能力。在自我組裝過(guò)程中，不同的細(xì)胞類型彼此之間采用特定的模式形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程涉及特異性的細(xì)胞-細(xì)胞識(shí)別、配體-受體信號(hào)和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用。

hESC分化過(guò)程產(chǎn)生相互作用的NPC群，后者自我組裝形成早期腎臟，這體現(xiàn)了PSC分化產(chǎn)生腎組織技術(shù)上的巨大進(jìn)步，然而，正常的腎臟發(fā)育涉及NPC自我更新與分化成腎單位之間的平衡。hESC誘導(dǎo)分化過(guò)程中形成許多腎小囊，但同時(shí)隨著時(shí)間推移NPC會(huì)顯著減少，產(chǎn)生祖細(xì)胞早熟的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象在Six2突變小鼠中可以見(jiàn)到，這一點(diǎn)是改進(jìn)分化誘導(dǎo)方法需要特別關(guān)注的一點(diǎn)。方法改進(jìn)的策略包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)和氧含量的改變，以便更充分的再現(xiàn)胚腎，此外，利用生物反應(yīng)器為類器官的培養(yǎng)提供3D環(huán)境，可能有利于類器官的分化組裝。

（三）腎臟類器官誘導(dǎo)過(guò)程中主要信號(hào)通路

目前文獻(xiàn)報(bào)道比較成功腎臟類器官誘導(dǎo)的策略主要有兩種：BMP/FGF途徑（圖1a）；CHIR99021-FGF途徑（圖1b）。BMP/FGF途徑：首先PSC在BMP4/activin A的刺激下向PSM分化，然后在FGF9的刺激下分化成IM，IM在FGF9/BMP7/RA的刺激下分化成MM和UB，二者進(jìn)一步分化成集合管、近端小管和足細(xì)胞在內(nèi)的類器官。CHIR99021-FGF途徑：PSC在Wnt激動(dòng)劑CHIR99021刺激下分化成PSM，后者在FGF9刺激下分化成IM，進(jìn)而分化成MM和UB，兩者相互誘導(dǎo)分化成包含集合管、腎小管和腎小球的腎臟類器官。

圖1 腎臟類器官誘導(dǎo)過(guò)程中主要信號(hào)通路

三、PSC誘導(dǎo)分化為腎臟類器官的分子機(jī)制及應(yīng)用前景分析

目前利用PSC誘導(dǎo)分化得到的類器官通常是不成熟的，類似于胎兒階段的器官，與真正的器官相比外形上小很多。在目前的培養(yǎng)體系中腎臟類器官通常長(zhǎng)到直徑2 ～ 3 mm，沒(méi)有血管并且缺乏尿排出的途徑，因此無(wú)論從體積還是復(fù)雜程度上距離達(dá)到臨床移植的標(biāo)準(zhǔn)還很遠(yuǎn)。然而，將腎臟類器官可應(yīng)用于疾病模型的制備、藥物篩選和再生治療，其中再生治療包括生物組織工程和細(xì)胞治療。多細(xì)胞性和不同細(xì)胞群體之間的特定相互作用使這些結(jié)構(gòu)信息可以反映腎毒性，體外缺乏可靠的對(duì)藥物毒性進(jìn)行評(píng)估的模型，這是新藥開發(fā)中的一個(gè)重要障礙。藥物進(jìn)入臨床需要腎毒性檢測(cè)，目前通常采用分離原代近曲小管上皮預(yù)測(cè)體內(nèi)反應(yīng)，這種方法并不太穩(wěn)定[20]。目前，研究正在嘗試?yán)萌薖SC誘導(dǎo)分化得到的腎近曲小管上皮進(jìn)行腎臟毒性檢測(cè)[21]，利腎臟類器官檢測(cè)藥物腎毒性可以提高檢測(cè)的可靠性，因?yàn)榻」芗?xì)胞周圍存在間質(zhì)成分，比單純的近曲小管細(xì)胞更接近體內(nèi)環(huán)境，利用成體胃腸道干細(xì)胞制備的胃類器官可用于幽門螺桿菌檢測(cè)已得到實(shí)驗(yàn)論證[22]，利用患者來(lái)源的iPS細(xì)胞產(chǎn)生的類器官可用于建立疾病模型。當(dāng)進(jìn)行鑒定新的致病基因研究時(shí)，制備患者特異性的類器官有利于對(duì)新基因進(jìn)行快速的功能鑒定，利用類器官開發(fā)高含量-低通量篩選模型進(jìn)行特定治療藥物的篩選是可行的。一般情況下，干細(xì)胞產(chǎn)生的類器官由于缺乏血管通常大小是有限的。放大這樣的組織或類器官用于移植在生物工程學(xué)上是一大挑戰(zhàn)，特別是像腎臟這樣的大器官。三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)已經(jīng)用于改善腦類器官的結(jié)構(gòu)，但開發(fā)能夠支撐類器官向更成熟體積更大的方向發(fā)展的器官培養(yǎng)器非常有必要。

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