N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylfomamide DMF）是一種用途廣泛的化工原料和優(yōu)良溶劑，可用于有機(jī)合成、無機(jī)化工、合成纖維、人造革等多個(gè)行業(yè)。由于DMF為無色胺味液體，具有揮發(fā)性，作業(yè)場所DMF可經(jīng)皮膚和呼吸道吸收進(jìn)入體內(nèi)，對肝臟、腎臟及肺等器官造成損害，尤其是對肝臟的毒性作用較大[1]，嚴(yán)重者可出現(xiàn)肝衰竭，甚至導(dǎo)致患者死亡[2-4]。目前DMF中毒者并無特效解毒藥，以保肝及對癥治療為主，人工肝為主的內(nèi)科綜合治療是這類患者最主要的治療手段，但人工肝治療僅能暫時(shí)和部分替代肝臟功能，難以起到促進(jìn)肝再生，改善肝功能的作用。近年來，大量研究表明干細(xì)胞具有促進(jìn)肝細(xì)胞再生和修復(fù)肝損傷的作用[5-6]，已有不少學(xué)者開展了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）治 療 肝衰 竭（失代償期）肝硬化臨床探索性研究，多數(shù)研究顯示BM-MSCs具有改善肝功能的作用。但主要集中在病毒和酒精所致的肝衰竭方面[7-8]，尚未見應(yīng)用于化學(xué)中毒性肝損傷的報(bào)道。本研究對1例急性DMF中毒性急性肝衰竭后肝功能遲遲得不到改善的患者，在內(nèi)科綜合治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合BM-MSCs肝動(dòng)脈輸注治療，取得較好的效果，現(xiàn)結(jié)合文獻(xiàn)分析報(bào)道如下。

資料與方法

一、臨床資料

患者，男，36歲，已婚，以“腹脹、乏力伴皮膚、鞏膜黃染約14 d，意識(shí)障礙1 d”入院。15 d前患者因食欲減退、腹脹、乏力，皮膚、鞏膜黃染，就診于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院，化驗(yàn)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）589 U/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）559 U/L，堿性磷酸酶（ALP）200 U/ L，總膽紅素（TBil）411 μmol/L，直 接 膽 紅素（Dbil）273.6 μmol/L，凝血酶原時(shí)間（PT）37 s，部分凝血活酶時(shí)間（APTT）70.1 s，纖維蛋白原（FIB）0.83 g/L。腹部彩超提示肝實(shí)質(zhì)回聲增粗增強(qiáng)。予以保肝、利膽、退黃、補(bǔ)充血漿和營養(yǎng)支持等治療效果不佳，且出現(xiàn)嗜睡、意識(shí)障礙，遂轉(zhuǎn)入我院進(jìn)一步診斷治療。入院前在某皮革廠從事配料工作，有約2個(gè)月的“DMF”接觸史。既往無肝炎病史，無藥物暴露史、大量飲酒史、食物中毒史和過敏史，查體：生命體征平穩(wěn)，嗜睡，呼之可應(yīng)，無法正確回答問題，查體欠配合。全身皮膚和鞏膜重度黃染，雙下肢、注射和穿刺部位可見瘀點(diǎn)、瘀斑，無肝掌和蜘蛛痣，心肺無異常，腹部飽滿，無壓痛、反跳痛，肝脾肋下未觸及，腹部移動(dòng)性濁音陽性，雙下肢無明顯水腫。實(shí)驗(yàn)室檢查：血細(xì)胞分析：白細(xì)胞（WBC）7.47×109/ L，NE 45.4﹪；肝功能：ALT 150 U/L，AST 187 U/L，ALP 93 U/L，TBil 356.0 μmol/ L，Dbil 118.3 μmol/L，血清白蛋白（ALB） 42g/L；凝血功能：PT 34.7 s，APTT 66.4 s；甲胎蛋白（AFP） 2.5 ng/ml，各種肝炎病毒檢測均陰性，巨細(xì)胞病毒、EB病毒DNA低于檢測下限，自身免疫性抗體及抗肝抗原均陰性。診斷急性重度DMF中毒，急性中毒性肝損傷，急性肝衰竭，肝性腦病（A型2級）。

二、方法

（一）內(nèi)科綜合治療

入院后立即予食醋灌腸酸化腸道、靜脈注射門冬氨酸鳥氨酸（7.5 g、2/d）和復(fù)方支鏈氨基酸注射液（250 ml、1/d）治療肝性腦病，異甘草酸鎂（150 g、1/ d）、還原型谷胱甘肽（2.4 g、1/d）保護(hù)肝細(xì)胞，補(bǔ)充人血白蛋白、凍干凝血酶原復(fù)合物、凍干纖維蛋白原、冷沉淀等血制品改善凝血肝功，及人工肝輔助支持治療。

患者入院后黃疸持續(xù)升高，ALT、AST下降，出現(xiàn)“膽酶分離”現(xiàn)象，凝血酶原活動(dòng)度（PTA）下降至10﹪左右。在人工肝為主（每2 ～ 3 d 1次）的內(nèi)科綜合治療3周后，患者病情進(jìn)展得到控制，肝性腦病好轉(zhuǎn)。但隨后患者的肝功恢復(fù)十分緩慢，從第3周到第8周，1個(gè)多月的時(shí)間內(nèi)肝功無明顯好轉(zhuǎn)，反映肝臟合成功能的指標(biāo)（PTA、ALB、CHOL）遲遲得不到改善，繼續(xù)大量補(bǔ)充白蛋白、血漿、凝血因子等血制品，PTA一直在40﹪以下波動(dòng)，TBil仍在正常檢測值上限的5倍左右，肝功能持續(xù)處于失代償狀態(tài)，8周時(shí)評估Child-Pugh分級仍為C級，終末期肝病模型評分21分?？紤]到患者存在大塊或亞大塊肝細(xì)胞壞死，有功能的肝細(xì)胞和肝小葉不足，肝功能恢復(fù)較困難。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，與患者簽署知情同意書后，入院后第8周為患者進(jìn)行了自體BMMSCs經(jīng)肝動(dòng)脈肝內(nèi)移植治療。

（二）BM-MSCs移植治療

BM-MSCs制備：在無菌條件下，局麻從髂骨抽取患者骨髓血15 ～ 20 ml, 在A/B級層流實(shí)驗(yàn)室按1 : 1比例加入到含有骨髓稀釋液的無菌離心管中，震蕩混勻。用無菌注射器吸取淋巴細(xì)胞分離液，將其鋪設(shè)于待分離的骨髓液下方，4 ℃條件下250×g，離心30 min（注意將離心機(jī)的剎車裝置關(guān)閉），用無菌注射器吸取分離液與骨髓液之間的淡黃色液層（單個(gè)核細(xì)胞層），將收集到的單個(gè)核細(xì)胞按1 : 1比例與骨髓稀釋液混合，4 ℃條件下250×g，離心15 min，棄上清后用骨髓稀釋液重新懸浮沉積到試管底部的骨髓細(xì)胞，接種于250 ml培養(yǎng)瓶，置于體積分?jǐn)?shù)為5﹪CO2飽和濕度的37 ℃恒溫孵育箱中培養(yǎng)，約10 d左右細(xì)胞生長融合，收集細(xì)胞制備成骨髓懸液，活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)量1×107個(gè)/ ml。流式細(xì)胞儀鑒定顯示 CD29+、CD44+、CD90+、CD34-、CD45-，符合國際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會(huì)提出的BM-MSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)[9]。

BM-MSCs輸注：在數(shù)字減影血管造影（DSA）下股動(dòng)脈穿刺插管，造影顯示肝固有動(dòng)脈，將50 ml（BM-MSCs濃度為5.0×106個(gè)/kg）制備成的BMMSCs緩慢注入肝動(dòng)脈，20 ml生理鹽水沖管。術(shù)畢穿刺點(diǎn)加壓包扎返回病房，穿刺側(cè)下肢制動(dòng)6 h。

結(jié) 果

一、肝功恢復(fù)情況

采取BM-MSCs移植治療后，肝功能恢復(fù)加速，BM-MSCs治療10 d后復(fù)查TBil較移植前下降了50﹪，PTA逐漸恢復(fù)到40﹪以上，術(shù)后4周ALB開始緩慢升高（圖1），8周肝功能評估Child-Pugh分級A級（6分），MELD評分7分。

圖1 患者肝功及凝血功能變化曲線

二、影像學(xué)變化

與3周時(shí)上腹部CT掃描（圖2a）比較，BMMSCs輸注后4周上腹部CT提示腹水消失，肝臟體積較前略有增大，肝左右葉比例失調(diào)，肝臟再生結(jié)節(jié)進(jìn)一步增大，增強(qiáng)掃描動(dòng)脈期結(jié)節(jié)強(qiáng)化較均勻，考慮再生結(jié)節(jié)以動(dòng)脈供血為主，且血流豐富（圖2b）。

三、病理改變

干細(xì)胞移植后8周在彩超引導(dǎo)下對再生結(jié)節(jié)行穿刺活檢，鏡檢（圖3）：肝組織病變不均勻，部分肝組織呈炎癥病理改變（G3，S2，F(xiàn)1），肝細(xì)胞腫脹，少量氣球樣變，少量點(diǎn)狀/灶性壞死，局部橋接壞死，輕度小泡性脂肪變性；部分肝組織呈慢性肝纖維化病理改變，肝細(xì)胞大塊狀壞死，被纖維組織取代，其間有細(xì)膽管增生和膽管內(nèi)小膽栓形成，以及再生的肝細(xì)胞島。

四、安全性及遠(yuǎn)期隨訪

患者在BM-MSCs移植術(shù)中及術(shù)后均未出現(xiàn)明顯與干細(xì)胞治療相關(guān)的不良反應(yīng)?；颊叱鲈汉竺?個(gè)月復(fù)查一次，臨床癥狀完全消失，可從事輕體力工作，生化提示ALP、GGT輕度升高，其余肝功能指標(biāo)均正常，Child-Pugh分級保持在A級。影像學(xué)檢查增強(qiáng)MRI上可見肝臟體積仍較小，肝葉比例失調(diào)，可見圓形結(jié)節(jié)形成，T1WI上高信號(hào)，T2WI上低信號(hào)，較前增大，逐漸充滿整個(gè)肝右葉，DWI上未見信號(hào)增高，結(jié)節(jié)間纖維間隔粗細(xì)不均，肝臟再生結(jié)節(jié)隨訪3年未發(fā)生惡變（圖2c、d）。

討 論

DMF是公認(rèn)已知的肝毒性化學(xué)藥物，廣泛應(yīng)用于人造革行業(yè)，在常溫下可揮發(fā)，即使是在佩戴手套和口罩的情況下作業(yè)，也可經(jīng)皮經(jīng)呼吸道吸收[10]，因此在炎熱的夏天，高溫、高濕條件下暴露DMF后，中毒的發(fā)生率較高[11]。DMF的中毒性機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為與其在體內(nèi)的代謝過程及代謝產(chǎn)物異氰酸甲酯（MIC）相關(guān)[12-13]，MIC具有親電活性，通過與蛋白質(zhì)、核酸等細(xì)胞大分子物質(zhì)共價(jià)結(jié)合造成細(xì)胞損傷，同時(shí)可與谷胱甘肽（GSH）結(jié)合生成S-（N一甲基氨基甲酰）谷胱甘肽（SMG），使內(nèi)源性SMG減少，導(dǎo)致體內(nèi)自由基清除減弱，自由基的增多加重細(xì)胞的損傷。Twiner等[14]研究還發(fā)現(xiàn)DMF可影響細(xì)胞內(nèi)的pH值，抑制肝細(xì)胞的增殖、分化，影響肝細(xì)胞的再生。

圖2 肝衰竭患者BM-MSCs移植前后肝臟影像學(xué)改變

BM-MSCs是骨髓中存在的一種具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，體外擴(kuò)增后移植入體內(nèi)可分化為肝細(xì)胞[15]，替代正常肝臟所需的合成和代謝功能，更重要的是可通過旁分泌途徑改變組織微環(huán)境，促進(jìn)內(nèi)源性細(xì)胞增殖和血管增生[6]，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)減輕肝臟的炎癥反應(yīng)[16]，調(diào)控肝星狀細(xì)胞改善肝纖維化[17]。將BM-MSCs移植應(yīng)用于DMF中毒性肝衰竭患者的救治，移植入體內(nèi)的BM-MSCs不僅可以通過旁分泌機(jī)制穩(wěn)定肝細(xì)胞再生、增值的內(nèi)環(huán)境，還可分化為肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞等進(jìn)一步改善肝功能。

本例DMF所致嚴(yán)重肝衰竭患者急性期病情得到控制后，肝功能遲遲得不到恢復(fù)，影像學(xué)提示肝臟明顯縮小，雖然能夠看到再生結(jié)節(jié)，但是大塊及亞大塊肝壞死致使肝臟有效體積仍嚴(yán)重不足，因此，肝細(xì)胞壞死得到控制后，肝功能不全的表現(xiàn)持續(xù)得不到改善情況下，應(yīng)用干細(xì)胞治療后，患者肝功能不全的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)快速恢復(fù)，Child-Pugh分級由C級轉(zhuǎn)為A級，終末期肝病模型評分由21 分降到7分，TBIL、PTA、ALB等主要肝功生化的變化規(guī)律與Peng等[7]的研究相一致。上述改變是在停止人工肝和其他內(nèi)科綜合治療措施不變的情況下出現(xiàn)的，雖然不排除隨著發(fā)病時(shí)間的延長肝功能自然恢復(fù)的存在，但從干細(xì)胞治療后的肝功能變化的時(shí)間節(jié)點(diǎn)上仍可以判定BM-MSCs移植在肝功能恢復(fù)中發(fā)揮了重要作用。

有文獻(xiàn)報(bào)道干細(xì)胞移植可能存在潛在的致癌性，間充質(zhì)干細(xì)胞在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)后，可出現(xiàn)染色體畸變，惡性轉(zhuǎn)化[18]；還可通過自分泌（旁分泌）途徑改變腫瘤細(xì)胞微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，刺激腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[19]。本例DMF中毒性肝衰竭經(jīng)BM-MSCs治療后，未出現(xiàn)相關(guān)的不良反應(yīng)，腹部CT提示肝內(nèi)再生結(jié)節(jié)增大，為排除惡變可能，行肝穿刺活檢，病理提示肝組織病變不均勻，呈多形性損傷。光鏡下肝組織表現(xiàn)為慢性炎癥，部分肝組織呈局灶性肝纖維化，符合化學(xué)藥物中毒引起區(qū)域性亞大塊肝壞死的特殊病理表現(xiàn)[20-21]，其間有成簇的再生肝細(xì)胞島，考慮為特異性DMF中毒肝細(xì)胞島[22]，未見異形或癌變細(xì)胞。出院后每3 ～ 4個(gè)月復(fù)查肝臟影像學(xué)檢查，隨訪至今已達(dá)3年余，肝內(nèi)結(jié)節(jié)無明顯增大，尚未觀察到干細(xì)胞移植后肝臟癌變跡象。

圖3 肝衰竭患者BM-MSCs移植后肝穿刺活檢病理特點(diǎn)

本文探索性地將BM-MSCs應(yīng)用于化工毒物DMF中毒性所致肝衰竭肝功延遲恢復(fù)的患者的治療，取得了明顯的療效，提示BM-MSCs對DMF中毒肝衰竭患者肝功恢復(fù)具有一定的促進(jìn)作用。但本文僅對1例患者進(jìn)行研究和觀察，其確切療效有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

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