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阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種老年中樞神經退行性疾病，其特征在于記憶、語言和認知功能逐漸喪失。據估計，在美國超過3﹪ ～5﹪65歲以上的人患有AD，人數多達500 多萬，全世界AD患者超過4 000萬人[1-2]。在我國，已有大約900萬人不同程度地患有AD。AD發(fā)生的主要病理改變是大腦海馬區(qū)域神經細胞內出現Aβ和Tau組成的變性蛋白聚集體，從而引起神經細胞的退行性改變[3]。目前沒有根治AD的藥物[4-6]，細胞治療為AD治療提供極大的臨床治療希望。

干細胞研究表明，發(fā)育中的大腦存在神經發(fā)生，成人中樞神經系統(tǒng)中也存在神經祖細胞（neural progenitor cells，NPCs）[7-8]。因此，干細胞移植可修復受損的中樞神經系統(tǒng)，進而治療神經系統(tǒng)相關疾病，特別是神經變性疾病，比如AD[9]。移植的干細胞來源主要包括胚胎干細胞[10-11]，神經干細胞[12-14]，成體骨髓間充質干細胞，成體臍帶間充質干細胞[15-18]和誘導多能干細胞[19-24]等。在本實驗中，用到的是免疫排斥小，效果好，易獲得的胎腦中的NPCs，通過加入提高細胞存活和加強細胞神經分化的細胞因子，以研究其對老年癡呆模型鼠記憶認知功能的改善及其機理的探究。Lu等[25]將多種生長因子創(chuàng)新性的組合在一起加入到神經干細胞中用于治療脊髓損傷模型大鼠，并取得了突破性研究。在本實驗中，首次將多種生長因子及纖維蛋白復合物組合在一起，并與NPCs移植入AD模型鼠中，以期觀察移植的NPCs在AD模型鼠腦內的存活并向特定神經元分化。

材料與方法

一、主要材料及試劑

1.實驗動物：實驗性SPF級C57BL/6J雄鼠20 只，孕鼠10只，購自濟南朋悅公司。SPF級APP/ PS1雙轉基因鼠50只，6到7月齡，購自北京華阜康公司。

2.實驗試劑：DMEM/F12基礎培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺（L-Glutamine）、非必需氨基酸（non-essential amino acid、NEAA）、青霉素-鏈霉素（penicillin streptomycin，PS）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，bFGF）、表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）購自 美 國 Invitrogen公 司；腦源性神經營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）、神經營養(yǎng)因子-3（neurotrophin-3，NT-3）、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、類胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors-1，IGF-1）購自美國Peprotech公司；MDL28170、纖維蛋白原（Fibrinogen）、凝血酶（Thrombin）購自美國Sigma公司；一抗：抗MAP2抗體，抗Tuj1抗體，抗ChAT抗體及抗GFAP抗體；二抗：抗兔lgG Cy-3抗體及抗鼠lgG 488抗體均購自美國Jackson ImmunoResearch公 司；Hoechst 33342購自美國Sigma公司；培養(yǎng)瓶、離心管、刻度吸管購自美國Corning公司。

二、實驗方法

1. NPCs分離與培養(yǎng)：所有涉及到動物模型的研究都經聊城市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（2014010）。取胎齡10 d的C57BL/6J孕鼠，斷頸處死，將鼠腦置于預冷PBS中，剝離腦膜，分離海馬區(qū)，機械法剪碎組織，然后加入脫氧核糖核酸酶Ⅰ工作液，用滴管吹打至單細胞懸液，400目濾網過濾，離心棄上清液，加入DMEM/F12洗滌1次，最后加入含 1 ﹪ PS、2 ﹪ B27、20 μg/L EGF 和 20 μg/ L bFGF的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，將細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，于37 ℃，5 ﹪ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

原代培養(yǎng)的NPCs在無血清的培養(yǎng)基中生長在前2 ～ 4 d時大部分死亡，到第7天左右，可發(fā)現由2 ～ 3個細胞組成的細胞團，培養(yǎng)至第14天左右時，在每個培養(yǎng)皿中均可發(fā)現數十至上百個呈懸浮生長的神經球。將包裝好的GFP慢病毒液（滴度1.0×108cfu/ml）加入到神經球培養(yǎng)皿中，獲得帶有GFP熒光標記的NPCs。

傳代的方法：用吸管將培養(yǎng)皿中的細胞懸液收集到15 ml的離心管中，400×g離心5 min，棄除上清，加入新鮮的NPCs培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打至大神經球分散為小的神經球或單個神經細胞，按照1:3的比例傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。

2. NPCs體外分化與免疫熒光染色：將細胞懸液400×g離心5 min棄上清，加入Accutase 37 ℃，消化10 min，然后用吸管輕輕吹打神經球至單個細胞，將其接種到涂有poly-L-ornithine/Liminin的24 孔板中，細胞密度為5×104個/孔。NPCs體外分化培養(yǎng)基為含有1﹪雙抗、2﹪B27的DMEM/ F12培養(yǎng)基。

細胞分化3 d后，用4﹪多聚甲醛固定，磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌，然后用含有10﹪正常山羊血清和0.1﹪Triton-X的PBS在室溫下孵育1 h，后將細胞與一抗 [MAP2，1:500 ；Tuj1，1:500 ；膽堿乙?；D位酶（choline acetyltransferase，ChAT），1:250和GFAP，1:250，均在4 ℃封閉溶液過夜?？雇胠gG Cy-3與抗鼠lgG 488分別用作二抗，在室溫孵育2 h。細胞核用DNA特異性熒光染料Hoechst 33342。

3.腦立體定位儀移植分離的NPCs：采用P4 ～P5代細胞，將細胞混懸液濃度調整為2.5×105個/μl，分為A、B兩管，各加入10種細胞因子（BDNF、VEGF、PDGF、HGF、EGF、bFGF、NT-3、GDNF、IGF-1及MDL28170），分別向A管中加入纖維蛋白原，B管中加入凝血酶（纖維蛋白原在凝血酶的作用下轉變?yōu)槔w維蛋白，將移植的細胞固定在注射部位）。隨機將AD模型鼠分為3組，每組10只，分為NPCs+因子組、因子組及PBS組，利用腦立體定位儀向AD模型鼠兩側海馬位置（AP : 2.06，ML : 1.75，DV : 1.75）定向移植NPCs，一側孔分別注射管A 2 μl，管B 2 μl。其余各組相同方法處理。術后3 d密切注意小鼠飲食，健康狀況。

4. Morris水迷宮記憶行為檢測：Morris水迷宮實驗裝置由圓形水池、平臺、攝像系統(tǒng)以及動物行為軌跡分析系統(tǒng)smart 3.0組成。水池直徑為120 cm，高50 cm。池壁上有N，E，S，W 4個等距離點，將水池分為NE，SE，SW，NW 4個區(qū)域。水迷宮實驗過程分為連續(xù)5 d的定位巡航實驗和第6天的空間探索實驗兩部分。每天訓練4次，每次使小鼠在不同區(qū)域下水，平臺即第5 區(qū)域，位于第4 區(qū)域內。每次游泳時間60 s，每次訓練間隔1 h左右。小鼠沒有找到平臺按60 s計算潛伏期。定位巡航實驗檢測小鼠學習獲得能力，空間探索實驗檢測小鼠空間記憶能力。用此方法對3個實驗組的AD模型鼠進行行為檢測，對照組為未做任何處理的同月齡C57BL/6J小鼠。移植細胞1個月后，進行行為測試，隨后每隔1個月進行1次檢測，持續(xù)6個月。

5.新物體識別實驗：訓練時將2個相同的物體置于同一測試盒內，讓被測試動物在測試盒內探求10 min。1 h后換掉其中1個物體（新物體在測試盒內的位置保持不變），然后將被測試動物再次置于測試盒內，考察其能否識別出其中一個物體是新物體。如果動物對已接觸過的物體有記憶，在測試的過程中它聞嗅新物體的時間占總聞嗅時間的百分比會明顯高于舊物體。50﹪代表小鼠對新舊物體的探究時間相同。

6.免疫組化：行為檢測結束后，將AD模型鼠麻醉灌流，取腦組織，在4﹪多聚甲醛中浸泡并固定24 h后，30﹪蔗糖溶液脫水24 ～ 48 h，然后包埋在Tissue-Tek OTC中并用低溫切片機切成20 μm的薄片。切片分別用NPCs增殖標志分子BrdU抗體、神經膠質細胞標志分子GFAP抗體，膽堿能神經元標志分子ChAT抗體，4 ℃過夜孵育。PBS沖洗后，用熒光標記的二抗Alexa Fluor 488或Cy3室溫孵育3 ～ 4 h，然后用細胞核抗體Hoechest33258孵育5 min。用熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結果。

7. Western blot：AD模型鼠麻醉生理鹽水灌流，取腦組織，分離海馬及皮層，移入EP管中，加入適量RIPA裂解液冰上裂解10 min；超聲破碎組織（50 Hz，1 min），500×g，4 ℃離心 15 min，吸取上清液；用BCA法定量測定蛋白濃度；將配制好的蛋白樣本于100 ℃恒溫加熱器上變性10 min 后冰上放置，進行SDS-PAGE 蛋白電泳，半干轉將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，室溫封閉1 h，TBST 洗膜2 ～ 3次，每次 5 ～ 10 min；室溫孵育一抗 2 ～ 3 h 或者 4 ℃孵育過夜，回收抗體后，TBST洗3次，每次5 min；室溫孵育二抗1.5 ～ 2 h或者4 ℃孵育過夜，回收抗體后，TBST洗3次，每次5 ～ 10 min；ECL法顯色，拍照，保存數據。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用GraphPad Pad 7.0軟件進行統(tǒng)計學處理。各組實驗動物水迷宮逃避潛伏期、跨平臺次數結果采用±s表示，組間比較采用F檢驗進行統(tǒng)計學分析，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、NPCs原代培養(yǎng)

胚胎來源呈懸浮生長的神經球，胞體體積較大，胞漿顏色較深，胞核（胞漿）比例比較大，組成神經球的細胞胞體大小基本一致，且每個神經球的大小基本也一致，形態(tài)規(guī)則，無突起生長，為典型的神經球形態(tài)（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡觀察原代培養(yǎng)的胎腦神經祖細胞形成神經球的過程（×100）

二、NPCs體外分化與免疫熒光染色

將神經球取出，Accutase消化，用吸管輕輕吹打神經球至其分散為單個細胞，將其接種到涂有poly-L-ornithine/Liminin的24孔板中。分化3 d后，細胞表達神經元細胞特異生物標志物TUJ1與MAP2，及膽堿能神經元細胞特異生物標志物ChAT，部分細胞還表達星形膠質細胞特異生物標志物GFAP（圖2）。

三、記憶認知功能檢測情況

1.水迷宮實驗測試結果：隨著連續(xù)5 d的訓練，所有小鼠尋找平臺所需時間均有降低。于第5天，對實驗組各組進行定位巡航實驗，得出各組逃避潛伏期結果（表1），結果顯示NPCs+因子組，以及因子組與PBS組比較，逃避潛伏期均有下降，表明兩組的AD模型鼠學習記憶能力均有改善（P ＜ 0.05）。24 h后，撤掉平臺，進行空間探索實驗，得出各組跨平臺次數，NPCs+因子組、因子組與PBS組比較，都有升高，表明兩組實驗鼠記憶保持能力也有提高（圖3）。

表1 AD模型鼠各組與WT組定位巡航實驗逃避潛伏期（s，±s）

表1 AD模型鼠各組與WT組定位巡航實驗逃避潛伏期（s，±s）

注：與 NPCs+因子組比較，aP ＜ 0.05；與因子組比較，bP ＜ 0.05；與對照組比較，cP ＜ 0.05

圖3 各實驗組空間探索實驗逃避潛伏期及跨平臺次數

連續(xù)進行6個月水迷宮行為測試，得出各實驗組逃避潛伏期時間變化曲線（圖4）。實驗結果表明，隨著時間延長，因子組實驗鼠的記憶能力逐漸減弱，移植細胞組的記憶改善能力仍維持移植初水平，表明移植入的NPCs細胞在AD模型鼠腦內存活，并對其記憶的改善能力發(fā)揮持續(xù)性效果。

圖4 不同時間各實驗組逃避潛伏期變化

圖5 各實驗組新物體識別實驗結果

2.新物體識別實驗測試結果：各實驗組對新物體探究時間占總探究時間百分比結果中（圖5），NPCs+ 因子組為（68.46 ± 2.40）﹪，因子組為（65.20±1.03）﹪，PBS 組為（54.47 ± 4.79）﹪，野生對照組為（77.10 ± 4.02）﹪，其中NPCs+因子組高于PBS組（F = 3.983，P = 0.018），因子組同樣高于PBS組（F = 21.63，P = 0.042）。表明兩組小鼠對新物體識別記憶能力均得到改善。

四、免疫組化結果

將分離的NPCs與GFP熒光標記共染后，注射到AD模型鼠海馬位置，行為檢測結束后處死取腦，得HE結果和免疫熒光結果（圖6）。ChAT熒光染色檢測各實驗組與對照組小鼠腦內膽堿能神經元分化情況（圖7）。

圖6 倒置熒光顯微鏡下觀察NPCs在AD模型鼠腦內海馬部位存活情況（×200）

圖7 倒置熒光顯微鏡下觀察各實驗組腦內膽堿乙?；D位酶染色情況（×200）

五、Western blot結果

提取各實驗組AD模型鼠及對照組老鼠腦內海馬部位，進行Western blot檢測，得出各實驗組ChAT表達情況對比（圖8）。

討 論

在過去十年中，幾乎所有以針對β-淀粉樣蛋白（β-Amyloid）斑塊的藥物治療AD在臨床試驗中都失敗了，表明需要采取新的方法來改善AD患者的學習和認知功能。NPCs是能夠分化為神經元和膠質細胞從而來代替損傷的神經細胞，并分泌神經營養(yǎng)分子調節(jié)恢復AD患者的記憶和認知功能。

分離了小鼠胎腦NPCs并聯合細胞因子共同移植到AD模型鼠中，發(fā)現能夠明顯改善AD小鼠的記憶認知功能。免疫熒光及Western blot結果顯示，在移植NPCs的區(qū)域，即AD模型鼠海馬區(qū)，移植的NPCs不僅能夠長時間存活，而且通過分化成了功能性的膽堿能神經元來改善AD模型鼠的記憶認知功能。表明NPCs能夠作為治療老年癡呆的潛在細胞來源。

此外，創(chuàng)新性的使用纖維蛋白支架（聯合使用纖維蛋白原與凝血酶）的方法保證了移植入AD模型鼠腦內的NPCs和營養(yǎng)因子成分能夠被固定在移植的海馬區(qū)域內，發(fā)揮其特定功能。動物行為檢測的結果也證明了AD模型鼠的認知記憶功能得到明顯改善，而且這種改善能力可以持續(xù)4到6個月甚至更長的時間。說明了這種纖維蛋白支架對于NPCs的生長分化存活有明顯支持作用，而且對AD模型鼠記憶功能改善的長時間維持也有著十分明顯的效果。

NPCs與纖維蛋白支撐物聯合多種營養(yǎng)因子移植明顯改善老年癡呆模型鼠的記憶認知功能，該實驗揭示了治療老年癡呆另一條更有效，更可行的治療途徑。而對于其改善記憶認知功能的原理仍需進一步實驗探究。

1 Holtzman DM, Morris JC, Goate AM. Alzheimer's disease:the challenge of the second century[J]. SciTransl Med, 2011, 3(77):77sr1.

2 Barnes DE, Yaffe K. The projected effect of risk factor reduction on Alzheimer's disease prevalence[J]. Lancet Neurol, 2011, 10(9):819-828.

3 Goldstein LS. Axonal transport and neurodegenerative disease:can we see the elephant?[J]. ProgNeurobiol, 2012, 99(3):186-190.

4 Gilman S, Koller M, Black RS, et al. Clinical effects of A beta immunization (AN1792) in patients with AD in an interrupted trial[J].Neurology, 2005, 64(9):1553-1562.

5 Rinne JO, Brooks DJ, Rossor MN, et al. 11C-PiB PET assessment ofchange in fbrillar amyloid-beta load in patients with Alzheimer's diseasetreated with bapineuzumab:a phase 2,double-blind,placebocontrolled,ascending-dose study[J]. Lancet Neurol, 2010, 9(4):363-372.

6 Mullane K, Williams M. Alzheimer's therapeutics:continuedclinic alfailures question the validity of the amyloid hypothesis-but what liesbeyond?[J]. Bio chem Pharmacol, 2013, 85(3):289-305.

7 Taupin P. The therapeutic potential of adult neural stem cells[J]. Curr Opin Mol Ther, 2006, 8(3):225-231.

8 Yamasaki TR, Blurton-Jones M, Morrissette D, et al. Neural stem cells improve memory in an inducible mousemodel of neuronal loss[J]. J Neurosci, 2007, 27(44):11925-11933.

9 張青, 周翠冰, 戴一凡, 等. 神經細胞異種移植的研究進展[J]. 器官移植, 2017, 8(4):83-87.

10 Tang J, Xu H, Fan X, et al. Embryonic stem cell-derived neural precursor cells improve memory dysfunction in Abeta(1-40)injured rats[J]. Neurosci Res, 2008, 62(2):86-96.

11 Moghadam FH, Alaie H, Karbalaie K, et al. Transplantation of primed or unprimed mouse embryonicstem cell-derived neural precursor cells improves cognitive function in Alzheimerian rats[J]. Differentiation,2009, 78(2-3):59-68.

12 Blurton-Jones M, Kitazawa M, Martinez-Coria H, et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(32):13594-13599.

13 Njiee G, Kantorovich S, Astary GW, et al. A preclinical assessmentof neural stem cells as delivery vehicles for anti-amyloid therapeutics[J].PLoS One, 2012, 7(4):e34097.

14 Zhang W, Wang PJ, Sha HY, et al. Neural stem cell transplants improve cognitive function without altering amyloid pathology in an APP/PS1 double transgenic model of Alzheimer's disease[J]. Mol Neurobiol,2014, 50(2):423-437.

15 Bae JS, Jin HK, Lee JK, et al. Bone marrow-derivedmesenchymal stem cells contribute to the reduction of amyloid-betadeposits and the improvement of synaptic transmission in a mousemodel of predementia Alzheimer's disease[J]. Curr Alzheimer Res, 2013, 10(5):524-531.

16 Lee JK, Jin HK, Bae JS. Bone marrow-derived mesenchymal stem cellsreduce brain amyloid-beta deposition and accelerate the activation ofmicroglia in an acutely induced Alzheimer's disease mouse model[J].NeurosciLett, 2009, 450(2):136-141.

17 Lee JK, Jin HK, Endo S, et al. Intracerebral transplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells reduces amyloid-beta deposition and rescues memory deficits in Alzheimer's disease mice by modulation of immune responses[J]. Stem Cells, 2010, 28(2):329-343.

18 Malm TM, Koistinaho M, Parepalo M, et al. Bone-marrow-derivedcells contribute to the recruitment of microglial cells in response tobetaamyloid deposition in APP/PS1 double transgenic Alzheimermice[J].Neurobiol Dis, 2005, 18(1):134-142.

19 Duff K, Suleman F. Transgenic mouse models of Alzheimer's disease:how useful have they been for therapeutic development?[J].Brief Funct Genomic Proteomic, 2004, 3(1):47-59.

20 Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stemcells from adult human fibroblasts by defined factors[J]. Cell,2007, 131(5):861-872.

21 Yu JY, Hu KJ, Smuga-Otto K, et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences[J]. Science, 2009,324(5928):797-801.

22 Park IH, Arora N, Huo H, et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells[J]. Cell, 2008, 134(5):877-886.

23 Zhou T, Benda C, Dunzinger S, et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples[J]. Nat Protoc, 2012,7(12):2080-2089.

24 Fabin Han, Wei Wang, et al. Human induced pluripotent stem cell-derived neurons improve motorasymmetry in a 6-hydroxydopamineeinduced rat model of Parkinson's disease[J].Cytotherapy, 2015, 17(5):665-679.

25 Lu P, Graham L, Wang Y, et al. Promotion of survival and differentiation of neural stem cells with fibrin and growth factor cocktails after severe spinal cord injury[J]. J Vis Exp, 2014, 89:e50641.