賴興泉 ，黃露露 ，王建輝 ，李保林 ，朱亞菊 ，蘇友新

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；2.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350101）

飛龍九一巴布貼由蘇友新教授研究團隊與臺灣旺騰草本藥學(xué)國際有限公司（以下簡稱臺灣公司）多年合作共同研制而成，現(xiàn)已在臺灣制成一般保養(yǎng)品試用并在衛(wèi)生署備案。前期在臺灣試用觀察表明：飛龍九一巴布貼能顯著緩解膝骨關(guān)節(jié)炎引起的酸痛腫脹等癥狀。為進一步明確該藥的安全性，研究團隊根據(jù)2014年國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［1］對其進行皮膚刺激性、致敏性及急性毒性實驗研究，以期為該藥的臨床推廣應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥物、試劑及主要儀器設(shè)備 所有實驗所需的飛龍九一巴布貼（高、中、低劑量分別相當(dāng)于臨床劑量的2倍、1倍及0.5倍）及不含藥物的空白基質(zhì)巴布貼均由臺灣公司提供；硫化鈉（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）；2，4-二硝基氯苯（DNCB，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；丙酮分析純（廣州化學(xué)試劑廠）。

1.2 動物 清潔級皮膚無破損的成年健康新西蘭大白兔66只，雌雄各半，體重1.8～2.3 kg；清潔級皮膚無破損成年健康豚鼠30只，雌雄各半（雌性未孕），體重約240～280 g。所有動物均由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供（許可證號：SCXK（滬）2012-0002），并由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)（許可證號：SYXK（閩）2014-0006）。 飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～26℃，相對濕度50%～60%，換氣次數(shù)為10～20次／min，照明12 h，明暗交替。所用動物均予全價營養(yǎng)飼料，豚鼠每日加用適量新鮮胡蘿卜及維生素 C（5 mg／100 g 體重）喂養(yǎng)［2］。 實驗前所有動物均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 皮膚刺激性實驗

2.1.1 單次皮膚刺激實驗 將12只新西蘭大白兔隨機分為飛龍九一巴布貼組（簡稱巴布貼組）和空白基質(zhì)對照組，每組6只，雌雄各半、單籠飼養(yǎng)。實驗前一天對兔脊柱中段兩側(cè)先剃毛再以硫化鈉脫毛 （左側(cè)為完整區(qū)、右側(cè)為破損區(qū)），每側(cè)面積10 cm×12 cm；實驗前檢查脫毛區(qū)域，若有動物因脫毛而出現(xiàn)皮膚破損或刺激反應(yīng)則不宜作為本次實驗動物。以75%乙醇清潔消毒后用無菌大頭針在破損區(qū)劃一長寬均約5 cm的“井”字形傷口，使破損僅達表皮、以滲血而不傷真皮為度。再在脫毛區(qū)敷貼以下藥物（面積為7.5 cm×10 cm）：巴布貼組貼中劑量飛龍九一巴布貼，空白基質(zhì)對照組敷貼空白基質(zhì)巴布貼，并以紗布、膠布加以固定，敷貼24 h后去除受試物。去除1、24、48、72 h后觀察敷貼部位紅斑與水腫等情況，參照文獻［1］記錄并計算每只兔皮膚刺激反應(yīng)分?jǐn)?shù)和刺激反應(yīng)強度。如72 h后上述紅斑、水腫仍未消退，則需延長觀察期限以評價上述變化的恢復(fù)情況和時間。同時取下出現(xiàn)中度及中度以上皮膚刺激反應(yīng)強度的皮膚進行組織切片，行常規(guī)HE染色觀察。

2.1.2 多次皮膚刺激實驗 將12只新西蘭大白兔按2.1.1實驗方法進行分組、脫毛、皮膚破損造模及敷貼對應(yīng)受試物，1 次／d，6 h／次，連續(xù) 7 d，每次去除受試物后記錄皮膚刺激反應(yīng)分?jǐn)?shù)（方法同2.1.1）。如7 d后上述紅斑、水腫仍未消退則需延長觀察期限以評價上述變化的恢復(fù)情況和時間，同時取下出現(xiàn)中度及中度以上皮膚刺激性反應(yīng)強度的皮膚并進行組織切片、行常規(guī)HE染色觀察。

2.2 皮膚致敏性實驗 取30只豚鼠，隨機分為飛龍九一巴布貼組（巴布貼組）、空白基質(zhì)對照組、DNCB對照組，每組10只，雌雄各半、同性分籠飼養(yǎng)。實驗前對豚鼠脊柱左側(cè)背部脫毛（脫毛方法同2.1.1，面積4 cm×4 cm）并于24 h后檢查，確認(rèn)該區(qū)皮膚完整、無刺激后先進行誘導(dǎo)性接觸：右側(cè)脫毛后巴布貼組敷貼高劑量飛龍九一巴布貼（敷帖面積為3 cm×3 cm），DNCB對照組涂抹1%DNCB丙酮溶液 0.2 mL，空白基質(zhì)對照組敷貼與巴布貼等面積的空白基質(zhì)巴布貼。3組敷抹后均以無菌紗布覆蓋皮膚，并用無刺激防水膠布粘貼固定6 h；第7天和第14天以同樣的方法重復(fù)給藥1次。激發(fā)接觸：末次誘導(dǎo)性接觸給藥后第14天（即本實驗第28天）脊柱右側(cè)背部脫毛并敷貼對應(yīng)受試物：巴布貼組敷貼低劑量飛龍九一巴布貼，DNCB對照組涂0.1%DNCB 0.2 mL，空白基質(zhì)對照組敷貼與巴布貼等面積空白基質(zhì)巴布貼，再以紗布及膠布粘貼固定。敷貼6 h后撕下，即刻觀察皮膚反應(yīng)情況，并于24、48、72 h后再次觀察。根據(jù)參考文獻［1］計算各時間點各組皮膚致敏分?jǐn)?shù)及致敏率，同時注意觀察豚鼠是否有哮喘、站立不穩(wěn)或休克等嚴(yán)重的全身性過敏反應(yīng)出現(xiàn)。

致敏分?jǐn)?shù)＝紅斑和結(jié)痂分?jǐn)?shù)＋水腫分?jǐn)?shù)。

致敏率＝出現(xiàn)過敏反應(yīng)動物數(shù)÷該組動物總數(shù)×100%。

2.3 急性毒性實驗 將42只新西蘭大白兔隨機分為7組，分別為完整皮膚基質(zhì)對照組、完整皮膚高劑量組、完整皮膚中劑量組、完整皮膚低劑量組、破損皮膚高劑量組、破損皮膚中劑量組、破損皮膚低劑量組，每組6只，雌雄各半、單籠飼養(yǎng)。7組均在脊柱背部右側(cè)皮膚脫毛，3組破損皮膚組行“井”形劃傷造模（脫毛與造模方法同2.1.1）。以空白基質(zhì)巴布貼敷貼完整皮膚基質(zhì)對照組動物，其余各組敷貼對應(yīng)劑量巴布貼并維持24 h。于去除受試物后連續(xù)7天觀察兔的一般狀態(tài)，并在敷貼前、敷貼后第7天稱量各組體重，實驗結(jié)束后進行大體解剖。若有動物實驗期間死亡應(yīng)及時尸檢并進行肝腎HE染色，分析死亡原因及該藥可能的毒性反應(yīng)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)處理分析，計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析；計數(shù)資料采用卡方檢驗。

3 結(jié)果

3.1 皮膚刺激性實驗

3.1.1 單次敷貼對皮膚刺激反應(yīng)分?jǐn)?shù)的影響 單次敷貼干預(yù)后，兩組皮膚完整區(qū)均未見刺激反應(yīng)；但巴布貼組破損區(qū)見輕度紅斑（刺激強度屬輕度刺激性），而空白基質(zhì)對照組仍未見皮膚刺激反應(yīng)（P＜0.05），提示飛龍九一巴布貼對破損皮膚有輕度刺激。見表1。

3.1.2 多次敷貼對皮膚的刺激情況 組間比較，兩組皮膚完整區(qū)均未見皮膚刺激反應(yīng)；但巴布貼組破損區(qū)存在輕度紅斑直到干預(yù)結(jié)束后第4天方恢復(fù)，而空白基質(zhì)對照組仍無皮膚刺激（P＜0.05），提示飛龍九一巴布貼對破損皮膚有輕度刺激。見表2、表3。

3.2 皮膚致敏性情況 DNCB對照組所有豚鼠激發(fā)接觸后有明顯過敏表現(xiàn)，致敏率達100%，屬極高致敏性；巴布貼組與空白基質(zhì)對照組激發(fā)接觸后未見紅斑、水腫等過敏表現(xiàn)，其致敏率為0；各組均未發(fā)現(xiàn)哮喘、站立不穩(wěn)或休克等嚴(yán)重的全身性過敏反 應(yīng)，見表4。

表1 單次敷貼對2組皮膚刺激反應(yīng)分?jǐn)?shù)的影響（x±s） 分

表2 多次敷貼對完整區(qū)與破損區(qū)皮膚刺激反應(yīng)分?jǐn)?shù)的影響 分

表3 多次敷貼對完整區(qū)與破損區(qū)皮膚刺激反應(yīng)分?jǐn)?shù)恢復(fù)的影響 分

3.3 急性毒性實驗

3.3.1 一般狀態(tài) 各組均未出現(xiàn)死亡，查其大小便、活動、攝食及飲水情況未見明顯異常及顫抖、流涎、腹瀉、少動、精神萎靡、昏迷等毒性反應(yīng)癥狀；實驗結(jié)束后對兔心、肝、脾、肺、腎等主要臟器進行大體解剖，觀察各臟器的顏色、質(zhì)地、大小、形狀等未見異常。

3.3.2 各組敷貼前后體重變化比較 組內(nèi)比較，各組體重較干預(yù)前均有增加；組間比較，干預(yù)前、后巴布貼各組體重均與完整皮膚基質(zhì)對照組無明顯差異（P＞0.05），見表 5。

表5 各組敷貼前后體重變化比較（x±s）kg

4 討論

本研究中皮膚刺激性實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兔皮膚破損區(qū)敷貼飛龍九一巴布貼后可見若干紅斑，而完整區(qū)與空白基質(zhì)對照組均未出現(xiàn)，說明該巴布貼對破損區(qū)皮膚有一定的刺激性，推測這可能與巴布貼組成藥物成分作用有關(guān)。提示飛龍九一巴布貼不能用于破損皮膚。

過敏又稱超敏反應(yīng)，是指機體受同一抗原再刺激后產(chǎn)生組織損傷或生理功能紊亂等特異性免疫反應(yīng)［5］，常表現(xiàn)為皮膚出現(xiàn)紅斑、水腫等癥狀。而在皮膚致敏性實驗中，除DNCB對照組外，空白基質(zhì)對照組與巴布貼組均未見皮膚紅斑與水腫等情況，說明該巴布貼及其基質(zhì)均不具致敏性。巴布貼劑是一種新型外用劑型，保濕性強，與皮膚相容性、親和性、透氣性好［6］，故不易出現(xiàn)過敏。提示飛龍九一巴布貼對正常皮膚是安全的。

急性毒性實驗結(jié)果表明飛龍九一巴布貼并無急性毒性，這可能與其所組成的方藥均為無毒之品有關(guān)。該巴布貼是由閩臺特色的藥食兩用草本植物飛龍掌血、九節(jié)茶、一條根等經(jīng)特殊工藝制成?！顿F陽民間藥草》認(rèn)為：飛龍掌血“辛苦，溫，無毒”；九節(jié)茶又名腫節(jié)風(fēng)、草珊瑚［7］，《生草藥性備要》記載其“味劫，性平”，現(xiàn)已被制作成多種食品、保健品［8-10］；一條根又名千斤拔，為闊葉大豆的根，《南寧市藥物志》言其“甘，平，無毒”，在臺灣由一條根制成的巴布貼、茶包等產(chǎn)品倍受當(dāng)?shù)厝藲g迎［11］?，F(xiàn)代單味藥物的毒理學(xué)研究也證實：飛龍九一巴布貼組方藥物無急性毒性、致畸性［7，10，12］。 此外，由于該產(chǎn)品采用巴布貼劑型外用，能有效避免藥物直接對胃腸道及肝腎等作用，從而進一步保證了飛龍九一巴布貼用藥的安全性。

綜上，本研究結(jié)果顯示飛龍九一巴布貼適合敷貼于無破損的皮膚，安全性好，無致敏性及毒副作用，值得推廣應(yīng)用。

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