王翠雪，王 麗，錢偉倫，于志文，王英豪

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

胰島素抵抗是肥胖、代謝綜合征和2型糖尿病等疾病的基礎(chǔ)機理，又與線粒體功能的損害密不可分［1］。而線粒體功能與線粒體分裂和融合的形態(tài)和功能改變密切關(guān)聯(lián)，當(dāng)線粒體功能損害時，一方面造成能量代謝紊亂，另一方面通過產(chǎn)生過氧化物并激活炎癥等信號途徑產(chǎn)生對胰島素信號的負反饋調(diào)節(jié)等，從而進一步誘發(fā)或加重胰島素抵抗和糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展。

白藜蘆醇是一種存在于虎杖、藜蘆、花生、葡萄等天然植物的多酚化合物。十年多來的大量研究證實：白藜蘆醇具有明確的改善胰島素抵抗作用［2］。然而，白藜蘆醇的藥效機理尚未完全闡明，尤其是其對線粒體功能的調(diào)節(jié)作用與胰島素抵抗的相關(guān)研究尚很不足。本研究通過高脂誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗模型，用白藜蘆醇藥物灌胃進行短期干預(yù)后，檢查與肝臟線粒體調(diào)控相關(guān)的信號蛋白表達和線粒體功能等生化指標(biāo)，以及肝臟炎癥信號關(guān)鍵蛋白的表達，探討白藜蘆醇是否可能通過調(diào)節(jié)線粒體功能和炎癥，起到改善胰島素抵抗的藥效作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與試劑 8周齡SPF級雄性C57BL／6J小鼠（許可證號：SCXK滬2013-0018）；低脂飼料（4.5%脂肪）、高脂飼料（45%脂肪）均購自廣州省醫(yī)學(xué)實驗動物中心；白藜蘆醇（成都曼斯特生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Na＋K＋、Ca＋＋Mg＋＋-ATP 酶測定試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；ECL顯影液（北京康為世紀(jì)生物科技公司）；IKBα、TNF-α、Mfn2、OPA1、Drp1 抗體（美國 Cell Signaling公司）；GAPDH抗體（美國Santa Crue公司）。

1.2 實驗儀器和材料Trans-Blot小型電泳及轉(zhuǎn)印槽、轉(zhuǎn)模儀（美國Bio-Rad公司）；血糖儀和血糖試紙（上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 胰島素抵抗模型的建立及藥物干預(yù) 8周齡SPF級雄性C57BL／6J小鼠30只，隨機分為低脂對照組（n＝10）、高脂模型組（n＝20），分別用低脂飼料（4.5%脂肪）和高脂飼料（45%脂肪）喂養(yǎng)。飼喂12周后，通過葡萄糖耐量實驗（IPGTT）檢測胰島素抵抗模型是否成功建立。再將成功的胰島素抵抗模型小鼠隨機分為模型組（n＝10）、藥物組（n＝10）。 藥物組給予白藜蘆醇50 mg／kg劑量每天灌胃1次，而對照組和模型組按體重給予等量生理鹽水每天灌胃1次，連續(xù)干預(yù)10 d。

2.2 血糖測定 3組小鼠連續(xù)干預(yù)10 d后，禁食12 h，取小鼠尾椎靜脈血檢測空腹血糖。然后每只小鼠腹腔注射 1.5 g／kg葡萄糖，分別于 15、30、60 min和120 min尾椎靜脈取血測定血糖。

2.3 組織蛋白樣品制備 3組小鼠禁食12 h后，脊椎脫臼處死，迅速取出小鼠肝臟，放入液氮速凍5 min，置于-80℃冰箱儲存。取50 mg肝臟組織，加入預(yù)冷的細胞蛋白裂解液，在冰上用組織研磨器勻漿，放入離心機內(nèi)14 000 rpm，4℃離心10 min，取上清。BCA試劑盒檢測蛋白濃度，制備蛋白樣品。

2.4 免疫蛋白印跡（Western Blot） 蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)于硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶 TBST 室溫封閉 2 h，一抗（1∶1000） 4℃孵育過夜，二抗（1∶2000）稀釋室溫反應(yīng) 2 h，洗脫劑TBST洗滌4次，用ECL顯影曝光并記錄。

2.5 Na＋K＋、Ca＋＋Mg＋＋-ATP-pase 含量測定 稱取小鼠肝臟組織 30 mg，按重量 ／g∶體積 ／mL＝1∶9 的比例，加入生理鹽水，冰上組織研磨器勻漿，3 000轉(zhuǎn)／min，離心10 min，取上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。 根據(jù) Na＋K＋、Ca＋＋Mg＋＋-ATP 酶測試盒說明書操作。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)使用軟件SPSS20.0統(tǒng)計分析。計量資料屬正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析檢驗。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 白藜蘆醇緩解高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗的糖耐量異常 高脂飼料喂養(yǎng)12周后，模型組小鼠糖耐量明顯損害，見圖1；白藜蘆醇藥物干預(yù)10 d后，藥物組小鼠血糖明顯低于模型組，見圖2。白藜蘆醇明顯改善高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗。

圖1 高脂飼料造模12周后糖耐量實驗結(jié)果圖

圖2 白藜蘆醇緩解胰島素抵抗小鼠糖耐量異常

3.2 白藜蘆醇抑制高脂造成的肝臟線粒體形態(tài)調(diào)控蛋白和功能異常 在小鼠肝臟組織中，白藜蘆醇促進線粒體融合蛋白 Mitof Usin2（Mfn2）、Optic Atroploy1（OPA1）表達，抑制線粒體促分裂蛋白Dyaminrelated Protein1（Drp1）的表達，見圖3。模型組與對照組比較，模型組小鼠肝臟中 Ca＋＋Mg＋＋、Na＋K＋ATP-pase含量明顯降低，而藥物組可以明顯逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，增加 Ca＋＋Mg＋＋、Na＋K＋ATP-pase含量。見圖4～5。

圖3 3組小鼠肝臟線粒體形態(tài)調(diào)控蛋白信號變化圖

圖4 3組小鼠肝臟線粒體調(diào)控蛋白密度統(tǒng)計圖

圖5 3組小鼠肝臟ATP酶活性含量圖

3.3 白藜蘆醇明顯抑制肝臟的炎癥信號及相關(guān)因子 白藜蘆醇可以明顯增加小鼠肝臟組織中NF-kB的抑制性蛋白IκBα的表達，相應(yīng)地減少腫瘤壞死因子（TNF-α）蛋白的表達。見圖6～7。

圖6 3組小鼠肝臟炎癥信號蛋白變化圖

4 討 論

圖7 3組小鼠肝臟炎癥信號蛋白密度統(tǒng)計圖

線粒體作為能量代謝的最重要細胞器，近年相關(guān)研究的重要進展之一是線粒體分裂和融合的線粒體形態(tài)變化與線粒體功能密切相關(guān)。前期研究證實線粒體調(diào)控的幾種關(guān)鍵蛋白，即Mitofusin 1（Mfn1）、Mfn2和OPA1在高脂模型小鼠肝臟均受到抑制［3］，相反，線粒體促分裂蛋白 Drp1明顯升高，這一結(jié)果與已有的報告結(jié)果一致［4］，并提示在高脂胰島素抵抗情況下，抑制了線粒體融合。本研究進一步表明：白藜蘆醇短期干預(yù)則可明顯緩解和逆轉(zhuǎn)高脂造成的這些線粒體調(diào)控蛋白的異常，線粒體ATP-pase的檢測結(jié)果也支持白藜蘆醇干預(yù)可以緩解高脂飼喂造成的小鼠肝臟線粒體功能障礙。

在線粒體功能障礙時，一方面其正常產(chǎn)能作用損害，另一方面線粒體產(chǎn)生的過氧化物增加［5］，線粒體可以改變氧化還原平衡狀態(tài)，激活炎性信號蛋白［6］。另外，線粒體與NF-κB炎性信號通路之間也有密切的對話，通過激活炎癥起到抑制胰島素信號傳導(dǎo)和功能作用［7］。本研究證實，白藜蘆醇可以抑制高脂造成的 IκBα降低并抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）炎性因子的表達。

參考文獻：

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