包福祥 阿米娜 蘆婷 趙鑫鑫 錢英紅 杜雅楠*

1.內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院

2.農業(yè)部動物疾病臨床診療技術重點實驗室

3.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院

犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)為負鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，可引起犬科、鼬科和浣熊科動物的急性、高度接觸性、致死性疾病，該病的主要傳染源為患病動物和隱性感染的帶毒動物。目前，犬瘟熱常年發(fā)生，呈散發(fā)、地方流行，傳染性強、發(fā)病率和死亡率高，是養(yǎng)犬業(yè)、經濟動物養(yǎng)殖和野生動物危害最大的疾病之一。CDV由15616個核苷酸組成，編碼基因按3’～5’端排序依次為：3’端前導序列、核衣殼蛋白基因（N）、磷蛋白基因（P）、基質蛋白基因（M）、融合蛋白基因（F）、血凝素蛋白基因（H）、聚合酶蛋白基因（L）和5’端引導序列。研究表明，CDV的N、F和H三種蛋白在病毒感染和宿主免疫方面起主要作用。因此，H、F和N蛋白的克隆和表達將對CDV的診斷和治療具有非常重要的意義。

一、材料和方法

1.材料

（1）主要試劑。英特威犬四聯(lián)疫苗（寵必威）由內蒙古農業(yè)大學教學獸醫(yī)院劉俊平教授提供；Trizol試劑為Invitrogen產品；反轉錄試劑盒購自Promega公司；T4連接酶為NEB公司產品；Ex-Taq DNA聚合酶、凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、DL2000、DL5000 Maker、pMD19-T（Simple）Vector、EcoRI、XhoI、BamHI限制性內切酶均購自Takara公司；大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)、Transetta (DE3)感受態(tài)購自北京全式金公司；Ni-NTA Sefinose(TM) Resin購自生工生物工程(上海)股份有限公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒購自碧云天公司。

（2）PCR引物。根據GenBank中發(fā)表的CDV Onderstepoort毒株基因序列，用Primer premier 5軟件設計了三對特異性引物H1/H2、N1/N2、F1/F2，引物序列如表1所示，并在PCR產物上、下游分別引入酶切位點，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 CDV H、F和N蛋白基因特異性引物

2.試驗方法

（1）CDV H、F、N基 因 的PCR擴 增。 利 用Trizol試劑法從英特威犬四聯(lián)疫苗中提取CDV總RNA，并以總RNA為模板，用oligo (dT)12-18為引物，反轉錄合成cDNA，再以合成的cDNA為模板，H1/H2、N1/N2、F1/F2為引物進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將CDV H、F、N基因PCR產物回收后與pMD19-T Simple Vector連接，轉化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞。

（2）CDV H、F、N蛋白表達載體的構建。將pMD19T-H，pMD19T-N，pMD19T-F重組質粒和pET-28a載體分別用XhoI/ BamHI 和XhoI /EcoRI進行酶切，酶切產物經1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并將得到的H、F、N片段和pET-28a載體進行切膠回收，再利用T4連接酶將回收的片段和載體連接，轉化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞，涂布含有Kana+抗性的LB固體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，提取質粒進行PCR鑒定和酶切鑒定。

（3）CDV H、F、N蛋白的誘導表達和純化。將鑒定正確的CDV H、F、N表達質粒轉化大腸桿菌Transetta（DE3）感受態(tài)細胞，涂布含有Kana+抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落至3 ml 含有Kana+抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃ 200 rpm過夜培養(yǎng)。取1 ml的菌液接種到100 ml含有Kana+抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 rpm培養(yǎng)2 h，菌液OD600值達到0.4～0.6，加入終濃度1 mM的IPTG誘導5～8 h，4000 rpm離心10 min收集細菌，用PBS緩沖液洗滌兩次后用超聲破碎儀進行細胞破碎，4℃1000 rpm離心10 min，分別收集破碎上清和沉淀，將沉淀用PBS溶液洗2次后加入3 ml帶有8 M尿素的Binding Buffer進行溶解。將1 ml Ni-NTA resin放入15 ml 離心管中，加入3 ml Binding Buffer洗滌兩次，然后將蛋白加入平衡好的Ni-NTA resin中，在冰上靜止結合2 h，4℃ 5000 rpm離心5 min，收集上清，標記為穿透液（FL），在Ni-NTA resin中加入2 ml Binding Buffer洗滌2次，洗滌液標記為W，最后加入2 ml含有150 mM咪唑的Elution Buffer洗滌2次，標記為E。將表達和純化產物進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測。

二、結果

1.CDV H、F、N基因的PCR擴增

以H、F、N基因特異性引物進行PCR擴增，產物經電泳檢測，如圖1所示，分別得到H基因990 bp、F基因939 bp和N基因1080 bp的片段，與預期目的片段大小相符。

2.CDV H、F、N蛋白重組表達質粒構建與鑒定

將CDV H、F、N基因連接pET-28a載體構建表達質粒，以重組表達質粒為模板，以H1/H2、N1/N2、F1/F2為引物，進行PCR擴增鑒定，如圖2所示，得到與預期大小相符的片段。

圖1 CDV H、F、N基因PCR擴增產物電泳結果

圖2 CDV H、F、N蛋白重組表達質粒PCR鑒定結果

圖3 重組表達質粒酶切鑒定結果

將重組質粒以XhoI/BamHI 和XhoI/EcoRI進行酶切，結果如圖3所示，可以得到大小為5000 bp左右的pET-28a載體和1000 bp左右的CDV H、F、N基因片段，證明目的片段已正確插入pET-28a載體。

3. CDV H、F、N蛋白誘導表達和純化產物SDSPAGE鑒定

將重組質粒轉化入大腸桿菌Transetta（DE3）感受態(tài)細胞中，經IPTG誘導，重組蛋白主要以包涵體的形式表達，誘導表達和經親和純化后的蛋白進行SDSPAGE分析，結果如圖4所示，顯示在相對分子量約37 KDa處有目的蛋白表達條帶，與預測的重組蛋白分子量相符。

圖4 重組蛋白SDS-PAGE鑒定結果

三、討論

犬瘟熱是目前危害犬科動物、經濟動物和野生動物的主要疫病之一。研究發(fā)現，CDV的H、F和N蛋白在病毒感染和機體免疫過程中具有非常重要的作用。CDV H蛋白由19441946個核苷酸構成，能夠誘導機體產生中和抗體，對CDV宿主的特異性起決定作用，是CDV重要的免疫原。H蛋白可通過結合到細胞表面的受體上而將CDV吸附到宿主細胞上，與F蛋白共同介導病毒與宿主細胞間發(fā)生膜融合，進入宿主細胞。F蛋白由2205個核苷酸組成，可以分為三個功能區(qū)：附著區(qū)、融合區(qū)和穿膜區(qū)，其中能對蛋白或整個病毒生物學特性造成影響的位于病毒粒子外側的附著區(qū)和融合區(qū)是病毒感染細胞并在宿主體內擴散所必需的重要成分。N蛋白是CDV含量最多的蛋白，由1683個核苷酸組成。N蛋白包括三個區(qū)域：N末端可變區(qū)、C末端可變區(qū)和中間的高度保守區(qū)，中間的保守區(qū)在N蛋白的結構和功能中起主要作用。N蛋白因為其較強的保守性，可以在感染初期就產生免疫應答反應，同時引起抗體反應。因此，在患病的初期診斷和治療中，N蛋白有較為重要的影響。本研究所表達和純化的CDV H、F和N蛋白為CDV的診斷方法和治療性抗體的開發(fā)奠定了堅實的基礎。