安 鵬，李星瑤，蔡子墨，黨慧敏，吳喜利

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院( 西安 710004)

原發(fā)性肝癌年病死率也已經(jīng)占到了我國腫瘤病死率的第二位。隨著放療技術(shù)發(fā)展，其己逐漸成為治療肝癌的主要非手術(shù)方法之一[1-2]。黃芩是傳統(tǒng)中藥，其具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎的功效。用于濕溫、暑溫胸悶嘔惡，濕熱痞滿，瀉痢，黃疸，肺熱咳嗽，高熱煩渴，血熱吐衄，癰腫瘡毒，胎動不安[3-4]。黃芩素是黃芩的主要提取物之一，研究表明黃芩素在體外抗腫瘤作用方面表現(xiàn)出活性，并且具有對常用抗癌藥物的體外增效作用[5-6]。目前，國內(nèi)外尚未有關(guān)于黃芩素體外放療增敏的相關(guān)研究[7]。因此我們擬在體外進(jìn)行黃芩素對肝癌細(xì)胞HepG2放療增敏的實驗研究，以探討黃芩素在放療增敏中的作用機(jī)制，從而為臨床肝癌放療增敏提供新的策略。

材料與方法

1 材 料 本組研究中人肝癌HepG2細(xì)胞株購買自ATCC細(xì)胞庫，黃芩素購買自曼斯特有限公司，純度大于99%，絲裂酶原購買自浙江海正藥業(yè)，新生胎牛血清及DMEM購買自GIBCO公司，MTT、碘化丙啶及二甲基亞砜購買自Sigma公司，RT-PCR試劑盒購買自福麥斯有限公司。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：快速將所凍存細(xì)胞于37 ℃水浴搖床60轉(zhuǎn)/min慢搖復(fù)蘇，復(fù)蘇后800轉(zhuǎn)/min離心5 min，吸去上清加入10 ml含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 ml，共10孔，5% CO2溫箱37 ℃培養(yǎng)。將所有細(xì)胞分為五組，即空白對照組：細(xì)胞+培養(yǎng)基、放療組：細(xì)胞+培養(yǎng)基+放療、藥物組：藥物+細(xì)胞+培養(yǎng)基、藥物加放療組：藥物+細(xì)胞+培養(yǎng)基+放療、肝細(xì)胞加藥物組：肝細(xì)胞+藥物+培養(yǎng)基，用MTT法實驗觀察黃芩素對細(xì)胞的生長抑制及殺傷作用，并檢測各組細(xì)胞克隆形成數(shù)及克隆形成率。

2.2 Western Blotting法：各組細(xì)胞以細(xì)胞裂解液處理后，在冰上裂解靜置30 min，后以BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。后行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，再100 V濕轉(zhuǎn)90 min，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以5% BSA封閉1 h，抗p53或β-actin抗體4℃孵育過夜，后用標(biāo)記二抗孵育1 h，后使用天能凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白水平。

2.3 QRT-PCR檢測p53mRNA表達(dá)：通過SYBR熒光實時定量PCR法檢測，觀察不同組別HepG2細(xì)胞中p53mRNA表達(dá)情況，基因表達(dá)的相對定量基于比較CT (threshold cycle)值法，mRNA相對表達(dá)量結(jié)果以相對熒光值表示。PCR反應(yīng)體系為20 μl，包含Power SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA 2 μl； ddH2O 6 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min， 1個循環(huán)， 95 ℃、變性30 s，退火40 s，72 ℃延伸40 s，共45個循環(huán)。每個樣本的RNA含量均根據(jù)各自的β-actin含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)：通過FCM檢測實驗，使用AnnexinV-FITC及PI染色雙染分析各組細(xì)胞凋亡率。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法：本組研究中使用SPSS 19.0存儲并處理原始數(shù)據(jù)，使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差及百分率表示計量及計數(shù)資料，使用方差分析及卡方檢驗分析組間數(shù)據(jù)差異，若P<0.05則認(rèn)為差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法檢測結(jié)果 見表1。本組研究結(jié)果顯示，藥物加放療組HepG2細(xì)胞存活率顯著低于其他組(P<0.05)。

表1 MTT法檢測結(jié)果

2 細(xì)胞克隆形成 見表2。本組研究結(jié)果顯示，藥物加放療組HepG2細(xì)胞克隆形成數(shù)及克隆形成率顯著低于其他組(P<0.05)，但仍顯著高于肝細(xì)胞加藥物組(P<0.05)。

3 蛋白表達(dá)水平 本組研究結(jié)果顯示，藥物加放療組HepG2細(xì)胞p-53/β-actin蛋白水平顯著高于其他組，見圖1。

表2 細(xì)胞克隆形成結(jié)果

4 mRNA表達(dá)水平 本組研究結(jié)果顯示，藥物加放療組HepG2細(xì)胞p-53/β-actin mRNA水平顯著高于其他組， 見圖2。

圖1 Western Blotting檢測結(jié)果

5 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 本組研究結(jié)果顯示，藥物加放療組HepG2細(xì)胞凋亡率顯著高于其他組，見圖3。

圖2 mRNA水平檢測結(jié)果

討 論

全球每年新發(fā)原發(fā)性肝癌約26萬例，而我國的原發(fā)性肝癌占42.5%。每年因肝癌死亡的人數(shù)約占全球的45%[8]。外科手術(shù)依然是早期肝癌治療的首選，但臨床就診患者多屬中晚期病人，手術(shù)切除率低。即使早期切除，術(shù)后5 年復(fù)發(fā)率也在60%以上。隨著放療技術(shù)的發(fā)展，放射治療己成為治療肝癌的主要非手術(shù)方法[9-10]。p53是重要的抑制腫瘤基因一直備受關(guān)注，而生理性誘導(dǎo)產(chǎn)生P53依然是在缺氧環(huán)境下，有國外學(xué)者認(rèn)為，缺氧環(huán)境下可以產(chǎn)生不同的P53，分別是突變型P53和野生型P53兩種，這兩種P53進(jìn)而在細(xì)胞凋亡及血管生長過程中發(fā)揮重要作用[11]。體外培養(yǎng)細(xì)胞與整體動物細(xì)胞在相同的低氧環(huán)境下，體外培養(yǎng)細(xì)胞中突變型P53較整體動物細(xì)胞能夠促進(jìn)組織血管的生長，并且更迅速地占據(jù)主導(dǎo)作用[12-13]。

本組研究結(jié)果顯示，藥物加放療組HepG2細(xì)胞存活率、細(xì)胞克隆形成數(shù)及克隆形成率顯著低于其他組，且藥物加放療組HepG2細(xì)胞凋亡率顯著高于其他組，HepG2細(xì)胞p-53/β-actin蛋白及mRNA水平顯著高于其他組?，F(xiàn)代藥理實驗證實黃芩具有抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)靜、抗凝血、降血脂、抗氧化和抗腫瘤等藥理作用。黃芩素是一種黃酮類化合物，是唇形科植物黃芩中提取、分離出來的主要有效成分之一，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)識黃芩具有清熱解毒、止血安胎的作用，現(xiàn)代藥理學(xué)也發(fā)現(xiàn)黃芩素具有利膽保肝、抗菌抗炎及抗腫瘤的作用。尤其對抗腫瘤的作用機(jī)制缺乏更加深入的研究[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素、黃芩苷在體外實驗中對抑制肝癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移都有顯著的作用，其機(jī)制可能與黃芩素及黃芩苷影響Rho家族基因的表達(dá)有關(guān)[15]。有實驗表明人白血病HL-60細(xì)胞通過使用小劑量黃芩素可使其停滯于S或G2/M期，而大劑量黃芩素可誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞凋亡[16]。另有實驗研究發(fā)現(xiàn)，黃芩的水提取物可明顯改善小鼠全身性缺氧和心肌缺氧狀態(tài)，

綜上所述，黃芩素一方面在抗腫瘤方面的作用確切，另一方面黃芩具有改善組織缺氧乏氧的作用。那么是否可以通過黃芩改善腫瘤乏氧環(huán)境的方式達(dá)到腫瘤放療增敏的作用。根據(jù)實驗結(jié)果表明黃芩素可有效提高肝癌細(xì)胞HepG2放療增敏作用，改善HepG2中p53蛋白及mRNA水平，但其具體機(jī)制有待于后續(xù)深入研究。

[1] Marques L A, Semprebon S C, Sartori D,etal. Comparison of the effects of monastrol and oxomonastrol on human hepatoma cell line HepG2/C3A[J]. Anticancer Research, 2017, 37(3):1197.

[2] 田 丹, 王 彥, 王 芹,等. LGK-974對人肝癌細(xì)胞系HepG2的輻射增敏作用[J]. 輻射研究與輻射工藝學(xué)報, 2016, 34(6):29-37.

[3] Huang X, Ma J, Xu J,etal. Simvastatin induces growth inhibition and apoptosis in HepG2 and Huh7 hepatocellular carcinoma cells via upregulation of Notch1 expression[J]. Molecular Medicine Reports, 2015, 11(3):2334-2340.

[4] Zhang Q, Lu C, Fang T,etal. Notch3 functions as a regulator of cell self-renewal by interacting with the β-catenin pathway in hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2015, 6(6):3669-3679.

[5] 朱傳東, 王禮學(xué), 王國相,等. 新型納米金材料的合成及其對HepG2細(xì)胞放射增敏的影響[J]. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志, 2016, 36(12):881-887.

[6] Grzegorczyk-Karolak I, lukaszKu ma, Wysoki ska H. Study on the chemical composition and antioxidant activity of extracts from shoot culture and regenerated plants of Scutellariaaltissima, L[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2015, 37(1):1736.

[7] Peng Y, Guo C, Yang Y,etal. Baicalein induces apoptosis of human cervical cancer HeLa cells in vitro.[J]. Molecular Medicine Reports, 2015, 11(3):2129.

[8] 楊忠霞, 劉小軍. 乳酸脫氫酶-A抑制劑草氨酸鈉對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J]. 蘭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版, 2016, 42(2):17-20.

[9] Yang X, Hao J, Zhu C H,etal. Survival benefits of western and traditional Chinese medicine treatment for patients with pancreatic cancer[J]. Medicine, 2015, 94(26):e1008.

[10] Xie S B, He X X, Yao S K. Matrine-induced autophagy regulated by p53 through AMP-activated protein kinase in human hepatoma cells[J]. International Journal of Oncology, 2015, 47(2):517.

[11] 蔡 陽, 朱傳東, 王禮學(xué),等. C225-GNPs對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞放射增敏作用的實驗研究[J]. 中華放射腫瘤學(xué)雜志, 2017, 26(1):95-97.

[12] Ueki S, Murakami Y, Yamada S,etal. microRNA-mediated resistance to hypoglycemia in the HepG2 human hepatoma cell line[J]. Bmc Cancer, 2016, 16(1):732.

[13] 孫力人, 何士方, 王 銳. 人參皂苷Rg3對鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞放療增敏的作用研究[J]. 實用癌癥雜志, 2016, 31(7):1053-1055.

[14] Hua Z, Tang J, Xu J,etal. Selenoprotein genes exhibit differential expression patterns between hepatoma HepG2 and normal Hepatocytes LO2 cell lines[J]. Biological Trace Element Research, 2015, 167(2):236-241.

[15] 王艷俊, 蔣永新, 劉 珊,等. 腫瘤放療增敏藥物新靶點[J]. 國際腫瘤學(xué)雜志, 2017, 44(2):129-132.

[16] Nobre L S, Jeremias H, Romao C C,etal. Examining the antimicrobial activity and toxicity to animal cells of different types of CO-releasing molecules[J]. Dalton Transactions, 2015, 45(4):1455-1466.