孫永敢，鄢為唯，聶少平，胡婕倫

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047）

黑木耳（Aurcularia auricular）屬真菌界、真菌門、子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬[1,2]，又稱木耳、云耳[3]。子實(shí)體群生或叢生，膠質(zhì)體，淺圓盤形、耳狀或不規(guī)則形狀，直徑為 2～12 cm[4]。根據(jù)《食物成分表》中的記載，每100 g黑木耳干品含有蛋白質(zhì)約10 g，與肉類相當(dāng)，遠(yuǎn)高于蔬菜，且吸收率也遠(yuǎn)高于肉類；高纖維、高糖、低脂；含鐵量約是豬肝的7倍，芹菜的20倍，肉類的100倍。黑木耳除了可供食用之外更主要的是它的藥用價(jià)值[5～7]，自古以來，就有用黑木耳治療多種疾病的記錄[8]?！渡褶r(nóng)百草經(jīng)》記載，“桑耳黑者，主女子漏下赤汁”，本草綱目謂之“木耳生犍為山谷，六月多雨時(shí)采”等[9]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，黑木耳具有多種生物學(xué)功效如降血糖、抗氧化、降血脂、清除人體內(nèi)自由基和抗癌等[10～14]。

研究表明，黑木耳的很多生物學(xué)功效都與黑木耳多糖的組分密切相關(guān)[15]，多糖是由大量單糖分子通過糖苷鍵相互連接形成的聚合物，多糖的提取工藝較為復(fù)雜且通過不同方法制備的黑木耳多糖的得率、糖含量、單糖組分等大不相同[16,17]。本實(shí)驗(yàn)通過比對(duì)超聲法、纖維素酶法、超聲協(xié)同纖維素酶法、超聲協(xié)同纖維素酶及胰蛋白酶四種不同提取工藝制得的黑木耳多糖的含量及得率，得出最優(yōu)提取方法并選出最優(yōu)的黑木耳多糖 AAP3，此工藝探討為黑木耳多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

AAP3經(jīng)過分級(jí)純化后，在異丙醇體積分?jǐn)?shù)為20%及 60%得到相對(duì)單一的多糖組分 AAP3-20和AAP3-60。此外，本實(shí)驗(yàn)還對(duì) AAP3-20和 AAP3-60進(jìn)行了分子質(zhì)量、單糖組成和紅外光譜等理化性質(zhì)和組成成分分析，為黑木耳多糖進(jìn)一步的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳干制品購自江西省吉安市井岡山產(chǎn)區(qū)，纖維素酶、胰蛋白酶（上海阿拉丁試劑有限公司，酶活力分別為10 U/mg、4.2 U/mg）；Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-50、Dextran T-70、Dextran T-500、藍(lán)色葡聚糖、巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸（美國(guó) Sigma公司，純度≥99.4%）；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、苯酚、濃硫酸、疊氮鈉、硝酸鈉、濃硫酸、95%工業(yè)乙醇、85%磷酸等試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

DFY-500搖擺式高速萬能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；pH計(jì)，德國(guó)Sartorius公司；KQ 5200E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；EYELA SB-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會(huì)社；冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco公司；Milli-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司；1260高效液相色譜，美國(guó)Agilent公司；多角度激光光散射凝膠色譜聯(lián)用系統(tǒng)，美國(guó)Wyatt Technology公司；TWCL-G磁力攪拌器，北京瑞成偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司；T6紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用有限責(zé)任公司；Dionex ICS-5000 DC離子交換色譜儀，美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳粗多糖的提取

1.3.1.1 超聲法

（1）稱粉碎后的黑木耳粉末40 g，過20目篩，pH 4.5，溫度 50 ℃，蒸餾水：原料=1：25（g/mL）浸提60 min，間歇攪拌；

（2）超聲加熱80 min，取出升溫至100 ℃，反應(yīng)10 min；

（3）80 ℃回流提取多糖2 h，過濾，旋蒸濃縮濾液，加入4倍濾液體積的95%乙醇，4 ℃過夜醇沉，沉淀復(fù)溶于蒸餾水中，冷凍干燥，得黑木耳粗多糖AAP1。

1.3.1.2 纖維素酶法

（1）同超聲法（1）；

（2）加入纖維素酶0.6 g，繼續(xù)加熱80 min，升溫至100 ℃，10 min滅酶；

（3）同超聲法（3），得黑木耳多糖AAP2。

1.3.1.3 超聲協(xié)同纖維素酶法

（1）同超聲法（1）；

（2）加入纖維素酶0.6 g，邊超聲邊加熱80 min，升溫至100 ℃，10 min滅酶；

（3）同超聲法（3），得黑木耳多糖AAP3。

1.3.1.4 超聲協(xié)同纖維素酶及蛋白酶復(fù)合法

（1）同超聲法（1）；

（2）加入纖維素酶0.6 g，邊超聲邊加熱80 min，降溫至40 ℃，調(diào)節(jié)pH至7.0加入胰蛋白酶0.12 g，反應(yīng)15 min，升溫至100 ℃，10 min滅酶；

（3）同超聲法（3），得黑木耳多糖AAP4。

1.3.2 多糖得率測(cè)定

總糖測(cè)定采用苯酚-硫酸法（以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)），還原糖用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定[18]。按如下公式計(jì)算黑木耳粗多糖得率：

1.3.3 多糖分級(jí)純化及含量分析

取總糖含量最高的AAP3復(fù)溶于蒸餾水中，采用Sevag法脫蛋白，取脫蛋白后的AAP3復(fù)溶于蒸餾水中滴加20%雙氧水，于40～50 ℃水浴中保溫2～3 h，進(jìn)行脫色，將脫色后樣液透析72 h，濃縮，冷凍干燥，得純化后黑木耳多糖AAP3-P。

取脫蛋白、脫色后的AAP3-P復(fù)溶于0.1 M NaCl的蒸餾水中，用異丙醇進(jìn)行梯度醇沉，于20%及60%體積分?jǐn)?shù)時(shí)收集到多糖組分（分別命名為AAP3-20及AAP3-60），復(fù)溶，透析，濃縮，冷凍干燥，得黑木耳分級(jí)多糖。對(duì)分級(jí)后的多糖進(jìn)行糖含量和蛋白含量分析，蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法（以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)）[19,20]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 多糖分子質(zhì)量及分布分析

采用HPSEC-MALLS分析AAP3的分子質(zhì)量分布情況：分別采用HPSEC廣譜校正和HPSEC串聯(lián)多角度激光散射的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)黑木耳多糖的 Mw及其分布進(jìn)行分析。HPSEC串聯(lián)多角度激光光散射檢測(cè)器（MALLS，DAWN HELEOS-II）、黏度檢測(cè)器（DP，ViscoStar-II）和示差檢測(cè)器（RI，Optilab T-rEX）。Model 1500 HPLC泵連接兩個(gè)分析柱：SB-806 HQ和SB-804 HQ（日本Showa Denko K.K公司，Shodex OHpak，8×300 mm），柱溫35 ℃。流動(dòng)相為0.2 mol/L NaNO3（含0.02% NaN3），流速為0.6 mL/min，ASTRA 6.1 software采集和分析數(shù)據(jù)。

準(zhǔn)確稱取5 mg樣品，用流動(dòng)相進(jìn)行溶解，配制成濃度為1 mg/mL的樣品溶液，并用0.22 μm水系濾膜過濾3次。

1.3.5 單糖組成分析

離子色譜工作條件：Dionex ICS-5000離子交換色譜系統(tǒng)，脈沖安培檢測(cè)器，色譜柱分別為 CarboPac PA20（3×30 mm）保護(hù)柱及 CarboPacTM PA20（3×150 mm）分析柱，流動(dòng)相包括A（250 mmol/L NaOH溶液）、B（H2O）及C（1 mol/L NaOAc），柱溫30 ℃，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，運(yùn)用Chromeleon色譜工作站采集處理數(shù)據(jù)。

樣品水解：精確稱取5 mg黑木耳粗多糖AAP3于20 mL具塞試管中，冰浴條件下，加入12 mol/L H2SO40.5 mL，磁力攪拌30 min，取出加入超純水2.5 mL，于100 ℃油浴中磁力攪拌2 h，取出轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，室溫放置約20 min后，吸取2 mL，加水至10 mL容量瓶中定容，得到多糖樣品水解液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 紅外光譜分析

稱取充分干燥的多糖樣品2 mg與KBr混勻研磨后壓片，上機(jī)掃描分析（掃描范圍400～4000 cm-1）。

1.3.7 甲基化分析

稱取干燥樣品3 mg，加入無水二甲基亞砜1 mL，磁力攪拌使樣品完全溶解，加入干燥 NaOH粉末 20 mg，密封并磁力攪拌3 h，冰浴攪拌下避光加入1 mL碘甲烷，密封并避光磁力攪拌2.5 h，滴加蒸餾水終止反應(yīng)，加入等量二氯甲烷進(jìn)行萃取，并用蒸餾水洗滌3次，加入過量無水硫酸鈉，吸出樣液，置于N2下?lián)]干，得干燥的甲基化多糖，紅外光譜檢測(cè)。若樣品在3500 cm-1附近沒有吸收峰，表示多糖上的羥基已甲基化完全。

用1 mL二氯甲烷將甲基化產(chǎn)物洗入安瓿管中，置于N2下?lián)]干，加入4 M三氟乙酸0.5 mL，真空下100 ℃水解6 h，用少量水將水解液轉(zhuǎn)移出安瓿管，置于N2下?lián)]干，加入蒸餾水0.3 mL及NaBD45 mg，室溫下過夜攪拌還原，滴加冰醋酸至無氣泡產(chǎn)生，置于N2下?lián)]干，依次用10%醋酸甲醇溶液及純甲醇除盡還原過程中產(chǎn)生的硼酯，加入醋酐0.5 mL，真空下100 ℃乙酰化2 h，得部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物，置于N2下?lián)]干，復(fù)溶于二氯甲烷中，進(jìn)行GC-MS分析[21,22]。

GC-MS工作條件：色譜柱為SP-2330 ms毛細(xì)管柱（美國(guó)Supelco公司，30 m×0.25 mm×0.2 μm），載氣為 He，升溫程序?yàn)?160～210 ℃（2 ℃/min）、210～240 ℃（5 ℃/min），離子化模式為 EI（70 kV）。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以下數(shù)據(jù)均用excel 2013、origin 7.0、SPSS17.0等軟件處理完成。各組數(shù)據(jù)以±s表示。應(yīng)用 SPSS 17.0軟件單因素方差分析，LSD檢驗(yàn)。p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取工藝條件下黑木耳多糖的含量及得率

圖1 不同提取工藝制得的黑木耳多糖含量及得率Fig.1 Content and yield of Aurcularia auricular polysaccharides extracted by different extraction methods

AAP3黑木耳多糖的含量最高，AAP4黑木耳多糖的得率最大，高于其他三組，AAP3的糖含量與AAP4無明顯差異，但AAP3與AAP4的得率有顯著性差異，我們可以推測(cè)胰蛋白酶對(duì)黑木耳多糖的糖含量無太大影響，但對(duì)黑木耳多糖的得率有較大影響。對(duì)比AAP1和AAP3的糖含量，得出纖維素酶酶對(duì)黑木耳多糖的糖含量影響較為顯著。AAP3的糖含量最高且得率高于AAP1和AAP2，綜合考慮，選定AAP3進(jìn)行進(jìn)一步的分級(jí)純化和結(jié)構(gòu)表征。

2.2 多糖純化

圖2 黑木耳多糖的化學(xué)組成Fig.2 Chemical composition of Aurcularia auricular polysaccharides

從圖2中可以看出，脫蛋白及脫色處理對(duì)糖含量有一定的影響。黑木耳多糖的多糖含量由純化前的85.93%（AAP3）下降至 66.56%（AAP3-P）。這可能是由于多糖與部分蛋白質(zhì)結(jié)合形成糖蛋白，脫蛋白時(shí)損失了部分糖，這也符合黑木耳多糖分子量較大，樣品溶液較粘稠的特性。相比之下，AAP3-20及AAP3-60樣品在經(jīng)過脫蛋白及脫色處理后，蛋白質(zhì)含量分別為1.06%和0.82%，證明這兩種級(jí)份多糖的純度較高，雜質(zhì)較少。

2.3 HPSEC分析

圖3 AAP3的HPSEC色譜圖Fig.3 HPSEC chromatogram of AAP3

圖4 AAP3-20的HPSEC色譜圖Fig.4 HPSEC chromatogram of AAP3-20

圖5 AAP3-60的HPSEC色譜圖Fig.5 HPSEC chromatogram of AAP3-60

HPSEC串聯(lián)多檢測(cè)器（多角度激光光散射檢測(cè)器MALLS、粘度檢測(cè)器DP和示差檢測(cè)器RI）技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于聚合物分子質(zhì)量和大小的分析。圖3為黑木耳多糖AAP3在不同檢測(cè)器下的洗脫曲線，如圖所示AAP3主要由四個(gè)峰組成，Peak1、2、3的重均分子量分別為 3.7×103、5.8×102和44 ku（Peak 4 分子量過小未能檢出）。

表1 AAP3-20和AAP3-60的分子參數(shù)Table 1 Molecular parameters of AAP3-20 and AAP3-60

對(duì)純化前黑木耳粗多糖AAP3和純化后級(jí)份多糖AAP3-20和AAP3-60進(jìn)行HPSEC分析（圖3、圖4和圖 5），結(jié)果表明純化后的精多糖 AAP3-20和AAP3-60的主要組分較純化前粗多糖AAP3均一。表1為 AAP3-20和 AAP3-60的主要組分分子參數(shù)。AAP3-20和 AAP3-60主要組分的重均分子量分別為2.53×103和1.20×103ku，數(shù)均分子量分別為 1.87×103和6.10×102ku，由此可知AAP3-20和AAP3-60的多分散系數(shù)PI（Mw/Mn）分別為1.36和2.12，表明該兩種級(jí)份多糖的分子尺寸是一種寬分布。ASTRA軟件分析多糖樣品的構(gòu)象，即由分子旋轉(zhuǎn)半徑 RMS與分子摩爾數(shù)之間的關(guān)系曲線可得，該關(guān)系曲線用α表示[23～25]。一般認(rèn)為α在0.5～0.8之間，表明多糖分子呈柔性無規(guī)則線團(tuán)；當(dāng)α增大，多糖的剛性隨之增強(qiáng)。當(dāng)α超過1時(shí)，表明多糖鏈呈棒狀結(jié)構(gòu)，低于0.3時(shí)則呈球形結(jié)構(gòu)[26,27]。AAP3-20和AAP3-60的α值分別0.439和0.723，表明AAP3-60的剛性較AAP3-20大，AAP3-20可能呈高支化緊縮鏈構(gòu)象，而AAP3-60可能呈無規(guī)則線團(tuán)結(jié)構(gòu)。

2.4 單糖組分分析

表2為AAP3、AAP3-20和AAP3-60的單糖組成，結(jié)果表明AAP3主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖組成，是一種雜多糖，其中葡萄糖含量最高（48.43%），其次是甘露糖、木糖，半乳糖，AAP3單糖組成總和（80.75%）與多糖含量結(jié)果（85.93%）相似。

AAP3-20組分僅由葡萄糖組成（77.82%），這與魏紅[28]報(bào)道的黑木耳多糖（CMAAP33）單糖組成一致；AAP3-60組分則含有4種單糖，其中大部分為甘露糖（51.91%）與木糖（43.62%），還含有少量的葡萄糖及半乳糖，AAP3-60單糖種類及比例與Anthony[29]提取的黑木耳多糖（AAPW-1）相近，但葡萄糖和甘露糖的比例有一定差異，這可能是黑木耳的產(chǎn)地或提取工藝不同導(dǎo)致。AAP3-20和AAP3-60兩種級(jí)份多糖中各單糖組成總和與多糖含量的結(jié)果基本一致。

表2 AAP3-20及AAP3-60單糖組成情況Table 2 Monosaccharide composition of AAP3-20 and AAP3-60

2.5 FT-IR光譜分析

AAP3-20和 AAP3-60的紅外光譜分析見圖 6，AAP3-20 和AAP3-60在3600～3200 cm-1，3000～2800 cm-1和1400～1200 cm-1的峰均是糖類化合物的特征吸收峰 cm-1處是多糖分子中O-H的伸縮振動(dòng)引起的吸收，說明存在分子內(nèi)和分子間氫鍵[30,31]。2910 cm-1波長(zhǎng)處的峰是多糖類 C-H或亞甲基伸縮振動(dòng)，1650 cm-1為羰基伸縮振動(dòng)，1380 cm-1之間的吸收峰是多糖類C-H的變角振動(dòng)[33]。1050 cm-1的中等強(qiáng)度的信號(hào)峰是C-O-H和吡喃糖環(huán)C-O-C中C-O鍵伸縮振動(dòng)引起的。相比于AAP-20，AAP-60在669 cm-1處存在吸收峰，說明該多糖為一種β-型吡喃多糖[33]。

圖6 黑木耳多糖的紅外光譜圖Fig.6 FT-IR spectrum of Aurcularia auricular polysaccharides

2.6 甲基化分析

在單糖組成基礎(chǔ)上，對(duì)AAP3-20和AAP3-60甲基化分析，甲基化分析通過甲基化試劑將多糖中各單糖殘基上的游離羥基甲基化，再將多糖中的糖苷鍵水解以暴露出單糖殘基的連接位點(diǎn)，再通過還原和乙?；磻?yīng)得到它們的衍生物進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析，確定出不同單糖殘基的連接位點(diǎn)。同時(shí)，根據(jù)不同單糖殘基在甲基化產(chǎn)物中的比例得到不同連接類型單搪在多糖中的分子比例[34,35]。AAP3-20和AAP3-60甲基化后對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜碎片、糖苷鍵類型及百分比見表3。

表3 AAP3-20和AAP3-60的甲基化分析結(jié)果Table 3 Methylation analysis of AAP3-20 and AAP3-60

AAP3-20甲基化PMAA產(chǎn)物主要由2,4-Me2- Glu（43.44%），2,3,4-Me3-Glu（26.90%），2,3-Me2- Glu（18.32%），2,3,4,6-Me4-Glu（11.34%）組成，結(jié)合單糖組成結(jié)果及文獻(xiàn)，AAP3-20殘基主要有1,3,6-Glcp，1,6-Glcp，1,4,6-Glcp，t-Glcp；AAP3-60中 1,4-Manp含量最高（61.36%），t-Glcp（22.57%），1,3-Xylp（8.81%），1,4,6-Manp（4.84%），1,6-Glcp（2.42%），該結(jié)論與劉大政[36]提取的黑木耳多糖（AA4HE2）甲基化結(jié)果幾乎一致，主要體現(xiàn)在1,4-Manp及1,3-Xylp殘基所占比例。根據(jù)Harker、Lee和Frechet的計(jì)算方法[37]，AAP3-20和AAP3-60的支化度分別為73.1%和27.4%，表明AAP3-20屬于支化度較高的多糖鏈。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)比四種黑木耳多糖的提取工藝，得出黑木耳粗多糖的最佳提取方式是超聲協(xié)同胰蛋白酶法，在該條件下制得的黑木耳粗多糖AAP3是一種葡萄糖含量較高的雜多糖。經(jīng)過進(jìn)一步的分級(jí)純化得到純度較高的 AAP3-20和 AAP3-60兩種組分多糖，AAP3-20僅由葡萄糖組成，而AAP3-60主要由甘露糖和木糖組成；甲基化結(jié)果表明 AAP3-20含有1,4,6-Glcp、1,3,6-Glcp、1,6-Glcp、t-Glcp四種殘基，AAP3-60 含有 t-Glcp、1,3-Xylp、1,4,6-Manp、1,4-Manp、1,6-Glcp五種殘基，結(jié)合HPSEC分析和甲基化結(jié)果表明，AAP3-20可能呈高支化緊縮鏈構(gòu)象，AAP3-60可能是一種呈無規(guī)則線團(tuán)結(jié)構(gòu)的β-型吡喃多糖。

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