熊泰特 ，萬小平 ，陳建林 ，肖永樂 ，陳義輝 ，熊 旗 ，李江，呂學(xué)斌 ★★，王澤洲 ，高 榮 ★

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川省生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省動(dòng)物疫病預(yù)防與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064；2.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066；3.四川省動(dòng)物疫病控制中心，四川 成都 610035）

細(xì)胞因子是由機(jī)體多種細(xì)胞分泌的小分子蛋白質(zhì)，通過結(jié)合細(xì)胞表面的相應(yīng)受體發(fā)揮生物學(xué)作用。它可使細(xì)胞間的各種信使分子連成一動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)，借以發(fā)揮其激活和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的多種功能，以便對外來的病原體感染或抗原性異物迅速作出免疫應(yīng)答和其他生理反應(yīng)（Smolen et al.,2005）。白細(xì)胞介素是一類研究最多、最深入的細(xì)胞因子，它們在免疫細(xì)胞的成熟、活化、增殖和調(diào)節(jié)等一系列過程中均發(fā)揮重要作用，此外它們還參與機(jī)體的多種生理及病理反應(yīng)（Magyari et al.,2014）。IL-2（TCGF），主要由 T細(xì)胞產(chǎn)生，以自分泌和旁分泌方式發(fā)揮效應(yīng)。其重要的作用是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖和分化（Lu et al.,1994），增強(qiáng) CTL的細(xì)胞毒活性,增強(qiáng)細(xì)胞間的接觸和誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-4、TNF和CSF 等）。

哺乳動(dòng)物抗菌肽是生物體免疫防衛(wèi)系統(tǒng)產(chǎn)生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性陽離子多肽活性物質(zhì),是生物體先天免疫的重要組成成分（Kuzina L V et al.,2006）?？咕淖鳛楣逃忻庖叩闹匾肿?，IL-2作為免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，二者各自的免疫生物效應(yīng)不同；在體內(nèi)是否具有免疫協(xié)同效應(yīng)？聯(lián)合應(yīng)用能否獲得能產(chǎn)生哪些調(diào)節(jié)效果,目前尚未見研究報(bào)道。

鑒于目前細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重，嚴(yán)重威脅人和動(dòng)物的健康；動(dòng)物因病原感染、應(yīng)激等出現(xiàn)的免疫抑制十分普遍，給動(dòng)物疫病的防治帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，目前迫切需要研發(fā)新型安全高效的抗感染制劑，全面增強(qiáng)動(dòng)物的抗感染先天免疫和獲得性細(xì)胞和體液免疫水平，本實(shí)驗(yàn)開展了新型融合抗菌肽基因CAMPS與豬白細(xì)胞介素基因2重組質(zhì)粒構(gòu)建及其共表達(dá)的生物活性及對小鼠免疫調(diào)節(jié)的研究，為我國動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)替代抗生素和增強(qiáng)免疫抗病力開拓新的途徑、提供新技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

宿主菌∶E.coliDH5α本實(shí)驗(yàn)室保存。

載體∶pVAX1，購自Life technologies公司。

CAMPS：融合抗菌肽基因，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

藏豬IL-2重組質(zhì)粒：本實(shí)驗(yàn)克隆保存。

人胚腎上皮細(xì)胞（HEK 293細(xì)胞）∶由四川大學(xué)國家生物材料工程研究中心王剛老師惠贈(zèng)。

殼聚糖（ CS）∶MW15kD，脫乙酰度95%以上，購自Sigma-Aldrich公司。

21日齡昆明雌性小鼠：購自成都達(dá)碩生物科技有限公司。

1.2 共表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用IN-fusion克隆技術(shù)對實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的CAMPS和IL-2分別進(jìn)行修飾和重組，構(gòu)建出CAMPS-IL2重組片段：IL2+2A+TPA+CAMPS。

將重組片段連入pVAX1表達(dá)載體，連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌Mach1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR篩選陽性克隆并測序，重組質(zhì)粒記作VAP2。

1.3 CS-DNA納米顆粒的制備

用離子交聯(lián)法制備CS-DNA納米顆粒。將CS溶解于pH5.5的醋酸溶液中，制備成濃度為2.4mg/mL的殼聚糖溶液，在55℃水浴磁力攪拌50rpm下過夜，徹底溶解后用濾膜（0.22μm孔徑）無菌操作臺(tái)過濾除菌。然后將其與質(zhì)粒按照質(zhì)量比30∶1的比例，在50～55℃水浴磁力攪拌情況下將質(zhì)粒緩慢滴加至殼聚糖溶液中，混合均勻，恒溫10min，最終得到包裹的納米顆粒。用Zetasizer3000 HS/IHPL納米粒度分析儀測定其粒徑、分散度及Zeta電位。

1.4 體外轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞

將HEK293細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上。用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至3×105個(gè)/mL，然后分配到6孔板中培養(yǎng)24h，至第2天細(xì)胞在孔板上達(dá)到90%左右的匯合度為準(zhǔn)。分別于轉(zhuǎn)錄后的24h、48h以及72h收集細(xì)胞，提取總RNA，通過實(shí)時(shí)PCR檢測重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1、VAP、VAP2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。同時(shí)利用轉(zhuǎn)染HEK293后48h的細(xì)胞上清液刺激豬外周血淋巴細(xì)胞，通過CCK8檢測VAP2、VAP、pVAX1的表達(dá)水平以及表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性。

1.5 小鼠實(shí)驗(yàn)

取30只體重位于20～25g左右的4周齡雌性昆明小鼠，隨機(jī)分成3組（標(biāo)記為A，B，C組），每組10只。于0d時(shí)A組小鼠注射含有100μg質(zhì)粒的VAP2/CS納米顆粒，B組小鼠注射同等劑量的VAP/CS納米顆粒，C組小鼠注射PVAX1/CS作為陰性對照。于 0d，7d，14d，21d，28d 采集各組小鼠尾靜脈血500μL左右，用于體內(nèi)重組質(zhì)粒的生物學(xué)分析。

1.5.1 免疫小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化

每組各取50μL外周血用于血常規(guī)檢測，分析小鼠外周血中白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板及血紅蛋白等的變化情況。

1.5.2 CD4+和CD8+細(xì)胞亞群的檢測

取新鮮抗凝小鼠尾靜脈血50μL，加入30μL生理鹽水（白細(xì)胞數(shù)量約為 105～107個(gè)）；然后吸取 1μLantimouseCD8-PE和 0.4μL antimouse CD4-FITC至 1.5mLEP管中，混勻，孵育20min；在流式細(xì)胞儀專用試管中加入0.2mL10倍裂解液，再加入1.8mL水，將孵育好的血液加入裂解液中，裂解5～10min；400～500g離心5min，棄上清。加入2mLPBS，吹打混勻，懸浮細(xì)胞；400～500g離心 5min，棄上清，留約100μL PBS輕輕吹打混勻，共洗滌1～2次；最后用100μL PBS吹打混勻細(xì)胞待檢測。

1.5.3 血清中IgG、IgG1、IgG2a的測定

200 μL外周血低速離心后分離血清，用以檢測體液免疫反應(yīng)。參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.4 熒光定量檢測免疫相關(guān)基因表達(dá)水平

根據(jù)根據(jù)GenBank中報(bào)道的小鼠相關(guān)基因：β-actin,TLR1,TLR4,TLR9,IL-2,IL-4,IL-23,以及IFN-γ基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)合成了8對擴(kuò)增引物。以β-actin作為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（IQ5 Real Time PCR cycler,Bio-Rad）分析上述基因的表達(dá)情況。

表1 熒光定量PCR設(shè)計(jì)引物

1.5.5 小鼠體重監(jiān)測

每周于固定時(shí)間測量每只小鼠體重，并做好記錄，用于小鼠生長情況分析。

1.5.6 攻毒實(shí)驗(yàn)

免疫接種28d后，3組小鼠隨機(jī)各選5只注射0.2mL OD=1的高耐藥金黃色葡萄球菌液，剩余小鼠則注射同等劑量的大腸桿菌液，飼養(yǎng)1周后觀察各組小鼠發(fā)病率和存活率。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

經(jīng)質(zhì)粒PCR以及HindⅢ、XbalⅠ酶切鑒定，測序驗(yàn)證，豬白細(xì)胞介素2與抗菌肽融合基因CAMPS成功構(gòu)建。VAP和VAP2融合基因克隆成功。VAP2 cDNA全長1150bp，編碼341個(gè)氨基酸。

2.2 包裹納米顆粒的粒徑、分散度和Zeta電位

通過0.7%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)樣品凝膠孔中三種納米顆粒被阻滯，孔外未檢測到質(zhì)粒分子。證明CS已成功包裹所有質(zhì)粒分子形成納米顆粒。Zeta-sizer 3000 HS/IHPL檢測納米顆粒的粒徑、分散度以及Zeta電位。檢測結(jié)果表明，所有的納米顆粒大小在250～350nm之間，均帶有正電荷，滿足轉(zhuǎn)染細(xì)胞要求。

表2 三種納米顆粒的粒徑和表面電位

2.3 CS/VAP、VAP2納米顆粒的體外生物學(xué)活性

首先，我們將CS包裹的VAP、VAP2納米顆粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)過24h、48h觀察，細(xì)胞均生長良好，說明此包裹材料具有較低的細(xì)胞毒性，轉(zhuǎn)染成功。隨后通過RT-PCR驗(yàn)證納米顆粒的轉(zhuǎn)染和基因表達(dá)效率。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染VAP和VAP2的HEK293細(xì)胞中提取的總RNA出現(xiàn)了目的條帶，大小約125bp，然而對照組卻沒出現(xiàn)特征條帶。通過PCR產(chǎn)物與定量分析在轉(zhuǎn)染量達(dá)到最高，因此我們后續(xù)就采用48h上清進(jìn)行淋巴細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)，CCK8檢測顯示VAP和VAP2上清增殖明顯高于對照組。

圖1 淋巴細(xì)胞刺激試驗(yàn)

2.4 CS/VAP、VAP2納米顆粒的體內(nèi)生物學(xué)活性

圖2 免疫小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a含量的變化

2.4.1 小鼠體重變化

注射后0～28d各組小鼠體重均曾上升趨勢。兩實(shí)驗(yàn)組小鼠生長速度均高于對照組（P＜0.05）。VAP、VAP2兩組小鼠生長并無明顯差異（P＞0.05）。

2.4.2 免疫小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a含量測定

如圖2所示，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a水平均均明顯高于對照組（P＜0.05）。IgG1與IgG2a的比值較對照組呈下降趨勢，說明納米顆粒更傾向于誘導(dǎo)小鼠的細(xì)胞免疫。A.IgG含量,B.IgG1含量,C.IgG2a含量,D.IgG1與IgG2a比值

2.4.3 CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的檢測

如圖3所示，實(shí)驗(yàn)組CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞含量均顯著高于對照組（P＜0.05），且較對照組CD4+/CD8+比值均有不同程度的上升，最后趨近于2。說明免疫接種后細(xì)胞調(diào)節(jié)和細(xì)胞免疫機(jī)能顯著提高。

圖 3 接種小鼠血液中CD4+和CD8+T細(xì)胞的變化

2.4.4 TLRs基因的表達(dá)情況

如圖4所示，在接種后7～28d，與對照組相比較，VAP和VAP2免疫小鼠TLR1,TLR4以及TLR9表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），且 VAP2組顯著高于 VAP組（P＜0.05）。免疫接種小鼠TLRs基因表達(dá)量的上升說明VAP和VAP2納米顆粒有利于機(jī)體有效識(shí)別感染病原分子，促進(jìn)先天免疫快速應(yīng)答反應(yīng)。

2.4.5 免疫前后細(xì)胞因子相關(guān)基因的表達(dá)情況

如圖5所示，在接種后7～28d，與對照組相比較，VAP、VAP2免疫小鼠IL-2,IL-4,IL-23,IFN-r基因的表達(dá)水平顯著升高，VAP2組顯著高于VAP組（P＜0.05）。說明說明VAP、VAP2納米顆粒能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化，促進(jìn)多種細(xì)胞因子的表達(dá)，且新型抗菌肽基因和白細(xì)胞介素2融合表達(dá)載體的免疫調(diào)節(jié)療效果更為明顯。

圖4 接種小鼠血液免疫細(xì)胞的 TLRs基因表達(dá)變化

圖5 接種小鼠血液免疫細(xì)胞中IL-2,IL-4,IL-23和IFN-r基因表達(dá)變化

2.4.6 小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖 6 小鼠攻毒后存活率

如圖6所示，用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌攻毒后，注射VAP和VAP2納米顆粒的兩組小鼠均存活且沒有出現(xiàn)細(xì)菌感染所引起的任何損害或癥狀。然而，對照組呈現(xiàn)了嚴(yán)重的細(xì)菌感染，80%的小鼠死于感染和損傷。對死亡小鼠進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)有明顯的腸系膜毛細(xì)血管腫大、充血、發(fā)黑，脾臟、肝臟發(fā)黑。取腹腔積液涂平板，革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)致死菌是金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌。

3 討論

白細(xì)胞介素2是白介素家族中重要的一員，主要由TH細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌產(chǎn)生。IL-2與其特異性受體相結(jié)合激活下游信號(hào)通路，能夠誘導(dǎo)NK細(xì)胞、單核細(xì)胞的增殖以及CTL的活化。此外，IL-2可刺激遲發(fā)型超敏反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)。有研究表明，IL-2作為一種新的免疫佐劑，既能避免常規(guī)佐劑的不良反應(yīng)，又能增強(qiáng)病毒、細(xì)菌和寄生蟲疫苗的免疫效果，提高抗體的均勻性，延長疫苗的保護(hù)時(shí)間，減少某些疫苗的副作用（Hossein et al.,2008）。

抗菌肽具有分子量小、水溶性好、熱穩(wěn)定性好、抗菌譜廣等特點(diǎn)（Kamysz et al.,2005）。 抗菌肽的作用機(jī)制與阻斷大分子生物合成的抗生素完全不同，它是通過作用于細(xì)菌細(xì)胞膜和DNA而導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，內(nèi)容物漏出，破壞細(xì)胞代謝途徑，并聯(lián)合DNA來抑制細(xì)胞復(fù)制和分裂，具有直接殺菌活性（Lohner K et al.,2005）。此外，抗菌肽具有多種免疫活性，能趨化中性粒細(xì)胞等免疫反應(yīng)細(xì)胞，誘導(dǎo)多種白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子以及生長因子的表達(dá)（Pieter S et al.2016）。

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)豬體內(nèi)有30多種抗菌肽（You-Ting et al.2016）,研究表明，它們不僅具有廣譜抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)功能，而且對真核細(xì)胞具有獨(dú)特的作用機(jī)制以及低毒性（Xu et al.2015）。 因此作為一種新的、安全的抗菌免疫調(diào)節(jié)劑，是一種理想的抗生素替代品。

殼聚糖是一種含有天然生物多糖甲殼素的脫乙酰基衍生物，具有良好的生物相容性（Prodpran et al.2007）。 它可被多種酶降解并且降解產(chǎn)物安全無毒，可被機(jī)體完全吸收（Zamani et al.2007）。由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，有研究結(jié)果表明，它作為緩釋材料具有不可估量的潛力（Baek et al.2008）。近年來，殼聚糖作為一種非病毒基因載體已被許多研究小組廣泛研究。含有治療基因或siRNA的殼聚糖/脫氧核糖核酸（CS/DNA）微粒被用于體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞（Mao et al.2010;Techaarpornkul et al.2010;Klausner et al.2010）。經(jīng)過大量研究表明，殼聚糖可以包裹DNA形成小尺寸的納米顆粒，能有效地?cái)y帶基因進(jìn)入靶細(xì)胞（Caifeng et al.2016）。

本實(shí)驗(yàn)將CAMPS以及豬白細(xì)胞介素2融合用于構(gòu)建CAMPS-2A-IL2（VAP2）。隨后將重組質(zhì)粒用殼聚糖包裹并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，同時(shí)利用轉(zhuǎn)染HEK293后48h的細(xì)胞上清液刺激豬外周血淋巴細(xì)胞，進(jìn)行淋巴細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)。接著將納米顆粒注入4周齡昆明小鼠體內(nèi)通過采集尾靜脈血檢測目的基因的生物學(xué)活性。

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組pVAX1相比較，兩實(shí)驗(yàn)組均能顯著促進(jìn)豬淋巴母細(xì)胞增殖（P＜0.05）。流式以及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明兩實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中CD4+,CD8+以及 IgG,IgG1,IgG2a的水平都要明顯高于對照組（P＜0.05），并且兩實(shí)驗(yàn)組相比較，注射VAP2的A組要高于注射VAP的B組（p＜0.05）,這表明接種VAP2質(zhì)粒的小鼠體液免疫功能有顯著提高。此外，IgG1/IgG2a比值的下降表明接種VAP2質(zhì)粒的小鼠更易誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)。

同樣的，定量結(jié)果表明兩實(shí)驗(yàn)組TLR1,TLR4，TLR9，IL-2，IL-4，IL-23和IFN-r基因的表達(dá)水平要明顯高于對照組（P＜0.05），同時(shí)VAP2組明顯高于VAP組（p＜0.05）。這表明VAP以及VAP2重組質(zhì)粒納米顆粒能夠提高小鼠的先天免疫和免疫調(diào)節(jié)水平，增強(qiáng)機(jī)體的防御能力，并且與VAP相比，VAP2更為有效。通過用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌攻毒后發(fā)現(xiàn)，注射VAP和VAP2納米顆粒的兩組小鼠均存活且沒有出現(xiàn)細(xì)菌感染所引起的任何損害或癥狀。然而，對照組出現(xiàn)了嚴(yán)重的細(xì)菌感染，大部分小鼠死于感染和損傷。

這些研究結(jié)果表明融合抗菌肽基因與白細(xì)胞介素2共表達(dá)可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生更好的先天性免疫和適應(yīng)性免疫。從而增強(qiáng)機(jī)體對病原體感染的協(xié)同免疫防御作用，為今后開發(fā)和應(yīng)用新型的、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的免疫調(diào)節(jié)劑來控制和預(yù)防動(dòng)物疾病提供了新的思路。

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