麗 春 ，付紹印 ，王建蒙 ，王 位

（1.內(nèi)蒙古民族大學動物科學技術(shù)學院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010031；3.內(nèi)蒙古ATCG生物信息研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

褪黑激素（melatonin，MT）是哺乳動物松果體分泌的主要產(chǎn)物，是一種吲哚類激素，具有多種生理功能，如抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)時差、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)毛皮動物絨毛周期和色素沉積等。近年來，對毛皮動物的研究表明，MT與非生絨季節(jié)促絨生長和季節(jié)性換毛有關(guān)［1-6］。絨山羊的絨毛生長受光照影響，呈現(xiàn)明顯的周期性變化，其毛囊在一年內(nèi)經(jīng)歷興盛、退行、休止3個時期。研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑激素處理可顯著影響絨山羊絨毛的生長［2，7-9］。 然而截至目前，人們對褪黑激素調(diào)控絨毛生長的機理仍然知之甚少。

RNA-Seq，即轉(zhuǎn)錄組測序，是基因結(jié)構(gòu)及功能研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點，通過高通量測序RNASeq，能夠獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列及表達信息，已被廣泛用于基礎(chǔ)生物學研究、臨床疾病診斷以及藥物開發(fā)等領(lǐng)域。通過RNA-Seq試驗可準確測定基因的表達水平、等位基因轉(zhuǎn)錄本的特異表達及可變剪接，以此來闡明生物機體發(fā)生生理或病理學變化的分子機制［10］。

目前，從全局水平了解褪黑激素影響絨山羊皮膚毛囊基因表達的研究較少。該研究以處于皮膚毛囊發(fā)育生長起始點（5月）的內(nèi)蒙古絨山羊罕山型個體為研究對象，基于RNA-Seq技術(shù)在基因轉(zhuǎn)錄層次上對皮下埋植MT個體和非埋植MT個體的皮膚基因表達情況進行比較研究，旨在篩選與MT影響毛囊發(fā)育調(diào)控相關(guān)的候選基因，為進一步闡明MT影響絨山羊絨毛生長的分子機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根據(jù)體重、產(chǎn)絨量、絨長、絨細度，選取飼養(yǎng)條件相同、體況良好的6只罕山型白絨山羊周歲母羊，平均分成2組，即MT埋植組（n=3）和對照組（n=3）。 試驗期間，按照 2 mg/（kg·BW）的劑量在埋植組絨山羊個體耳后皮下埋植MT，對照組不埋植MT，埋植后次月于肩胛部采集1 cm2大小的皮膚樣品，液氮快速冷凍帶回實驗室，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｍ蝗掌?4時左右于靜脈處采集血液樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 血液中MT含量測定：將肝素鈉抗凝的新鮮血液樣品2 500 r/min離心10 min（時間可根據(jù)血液分層情況適當增加），吸取上層血漿，用放免試劑盒（KIPL3300，Biosource公司）測定血漿中的MT濃度。

1.2.2 總RNA提取和文庫構(gòu)建：皮膚組織總RNA提取按照天根（北京）生化科技有限責任公司提供的動物組織總RNA提取試劑盒（DP501）說明書進行。利用NanoDrop ND-2000檢測提取產(chǎn)物濃度，采用瓊脂糖電泳以及Agilent 2100檢測總RNA完整性。cDNA文庫構(gòu)建參照Illumina（USA）的鏈特異性轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建試劑盒（Truseq RNA Sample prep kit v2）說明書進行。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析：6個轉(zhuǎn)錄組文庫由Illumina平臺的HiSeq 2500測序系統(tǒng)完成高通量測序。測序原始數(shù)據(jù)使用軟件Fastx_toolkit過濾接頭序列，剔除低質(zhì)量（質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整條reads的50%以上）以及含有 “N”（比例＞2%）的reads等不合格序列。過濾后的clean reads導(dǎo)入FastQC做進一步的質(zhì)量控制，以充分評估測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量。然后利用Tophat 2軟件將clean data比對到山羊參考基因組上（capra hircus：assembly ARS1），應(yīng)用cufflinks對樣本的每一個基因的表達量進行歸一化處理，計算FPKM值。使用cufflinks的cuffdiff模塊尋找兩兩樣本之間的差異表達基因，并通過fold_change、P-value對結(jié)果進行篩選和統(tǒng)計。然后利用多重假設(shè)檢驗（multiple hypothesis testing）對上述計算出的每一表達差異基因的P值進行校正，過濾出同時滿足倍數(shù)改變以及P-value顯著效應(yīng)的序列進行后續(xù)分析。

對表達具有顯著性差異的基因運用在線服務(wù)軟件 DAVID（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）進行 GO和KEGG pathway的富集性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 夜間血液中MT含量的變化

罕山絨山羊在一個絨毛生長周期內(nèi)夜間血漿中MT含量的變化情況見圖1。由圖1可知，對照組血漿中MT水平在7～26 pg/mL，而埋植組血漿中MT平均濃度高達174.02 pg/mL，平均高出對照組10.9倍。

2.2 RNA-Seq測序結(jié)果及比對結(jié)果

選取絨毛生長興盛前期（5月）埋植組（樣品編號：MT-1、MT-2、MT-3）與對照組（樣品編號：CK-1、CK-2、CK-3）皮膚樣品進行轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建及測序。6個轉(zhuǎn)錄組文庫共獲得了32.03 GB的原始數(shù)據(jù)，通過質(zhì)量控制最終得到了31.79 GB數(shù)據(jù)用于后續(xù)生物信息分析，平均每個樣品測序數(shù)據(jù)量達到了5.3 GB。測序質(zhì)量及GC含量見表1。將獲得的6個樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過Tophat 2比對到山羊參考基因組，序列比對結(jié)果見表2，比對成功率為（78.75±2.17）%。

2.3 差異表達基因的篩選

圖1 埋植組與對照組絨山羊血漿MT濃度在1年內(nèi)的變化趨勢

表1 6個轉(zhuǎn)錄組文庫測序結(jié)果

圖2 基因表達量火山圖

表2 測序數(shù)據(jù)比對到參考基因的結(jié)果 %

FPKM是指每一百萬個比對上的片段中比對到外顯子的每1 000個堿基上的片段個數(shù)，該值反映了基因的表達水平，可以用于不同樣品之間基因表達差異的比較。在該研究中，埋植組表達的基因數(shù)目為14 726個（FPKM＞0.2），對照組表達的基因數(shù)目為14 943個（FPKM＞0.2）。通過差異基因篩選（log2|（FC）|＞1，P-value＜0.01），共獲得了 462個差異基因，其中上調(diào)表達基因208個，下調(diào)表達基因254個（見圖2）。表3列出了埋植MT以后上下調(diào)前10位的基因。

2.4 差異基因的富集分析

將上述差異基因使用在線軟件DAVID進行GO及KEGG pathway的功能富集。KEGG富集分析結(jié)果如圖3所示。其中，橫軸代表pathway顯著性水平（P-value）的-log2 P值，縱軸代表KEGG數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的pathway條目名稱，條形圖上的數(shù)字表示參與該pathway的差異基因數(shù)目。由圖3可知，差異表達基因主要富集的信號通路為：代謝途徑（metabolic pathways）、不飽和脂肪酸生物合成（biosynthesis of unsaturated fatty acids）、 脂肪酸代謝（fatty acid metabolism）、癌癥信號通路（pathways in cancer）、鱗狀細胞癌信號通路（squamous cell carcinoma）、黑色素合成（melanogenesis）、Wnt信號通路（Wnt signaling pathway）、補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)（complement and coagulation cascades）。

3 討論

MT對絨毛生長影響的研究由來已久。Rust等［11］報道，使用外源 MT 可促使白鼬（Mustela er-minea）冬皮提早成熟；Kim 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，局部注射MT可能會影響人類頭發(fā)的生長。在絨山羊絨毛周期性生長方面，研究者發(fā)現(xiàn)，持續(xù)埋植MT可導(dǎo)致山羊體表出現(xiàn)常年長絨現(xiàn)象［13-15］。內(nèi)蒙古絨山羊于每年7—8月體表開始長絨，持續(xù)一年埋植MT可導(dǎo)致其翌年5月時體表長出夏季絨毛［13-14］。該研究從2014年12月開始對罕山型白絨山羊持續(xù)埋植MT，翌年4月脫絨后，埋植組絨山羊在5月時體表就已長絨，而對照組在7月才開始長絨。為此，選擇5月的皮膚組織作為研究對象，進行RNA-Seq測序和分析。分析結(jié)果表明，埋植組絨山羊皮膚組織中表達倍數(shù)改變在2倍以上的差異基因達到了462個，其中上調(diào)表達基因208個，下調(diào)表達基因254個；經(jīng)KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要富集的信號通路為：代謝途徑、不飽和脂肪酸生物合成、脂肪酸代謝、癌癥信號通路、鱗狀細胞癌信號通路、黑色素合成、Wnt信號通路以及補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)。Wnt/β-catenin信號通路作為表皮和間充質(zhì)間相互作用的主要調(diào)節(jié)器，能夠調(diào)節(jié)毛囊的發(fā)育［16-17］，在胚胎毛囊發(fā)育過程

中可能是BMP的遺傳上游通路［18］。Wnt信號通路中的 FZD10、WNT11、WNT4、PLCB1、DAAM2、WNT2B等基因在埋植MT后皮膚組織中的表達量發(fā)生了明顯的變化，因此，MT可能通過調(diào)節(jié)這些基因的表達變化，進而提前激活皮膚毛囊的活性，促使絨山羊二次生絨。

表3 MT埋植后上、下調(diào)前10位的基因

圖3 差異基因KEGG富集分析結(jié)果

4 結(jié)論

該研究應(yīng)用生物信息學方法對6只處于皮膚毛囊發(fā)育生長起始點（5月）的罕山型白絨山羊皮膚組織的高通量測序結(jié)果進行了分析，篩選獲得了462個在MT埋植組與對照組中差異表達的基因，其中，上調(diào)表達208個，下調(diào)表達254個。KEGG富集性分析表明，差異表達基因主要參與：代謝途徑、不飽和脂肪酸生物合成、脂肪酸代謝、癌癥信號通路、鱗狀細胞癌信號通路、黑色素合成、Wnt信號通路以及補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)等。Wnt信號可能在褪黑激素調(diào)控皮膚毛囊發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

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