余 俊，劉彤鷗，李曉蘭

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院 湖北省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430061；2.宜昌市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 宜昌 443000)

宮頸癌為女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，具有惡性程度高、侵襲力強(qiáng)、預(yù)后差等特點(diǎn)，近年來發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢(shì)[1]，嚴(yán)重威脅女性健康。目前，宮頸癌的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)作為存在于細(xì)胞質(zhì)中的非受體酪氨酸蛋白激酶，參與機(jī)體多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，在調(diào)控細(xì)胞增殖、黏附、遷移、運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及血管新生密切相關(guān)[3]。本研究利用小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)特異性沉默人宮頸癌Hela細(xì)胞的FAK基因，觀察其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特征的影響，并探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源人宮頸癌Hela細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，由湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)胞室保存。

1.2主要試劑與儀器達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基F12(Dulbecco′s modified Eagle′s medium：nutrient mixture F-12，DMEM/F12)、胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibo公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，F(xiàn)AK及內(nèi)參引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成，siRNA-FAK、siRNA-陰性對(duì)照序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，噻唑藍(lán)[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自上海博谷生物科技有限公司，Annexin V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V fluoresceinisothiocyanate/propidiumiodide，annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司，兔抗人RAF原癌基因絲氨酸/蘇氨酸激酶-1(RAF proto-oncogene serine/threonine kinase 1，Raf-1)單克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗人FAK多克隆抗體、兔抗人磷酸化Raf-1(phosphorylation of Raf-1，p-Raf-1)抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗人絲裂原活化蛋白激酶1/2(mitogen-activated protein kinase 1/2，MEK1/2)多克隆抗體、兔抗人磷酸化-MEK1/2(phosphorylation of MEK1/2，p-MEK1/2)多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗人細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)單克隆抗體、兔抗人磷酸化-ERK(phosphorylation of ERK，p-ERK)多克隆抗體購自美國CST公司，聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)購自濟(jì)南朋遠(yuǎn)生物科技有限公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemilluminescence，ECL)試劑盒購自美國Promega公司，AMR-100全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀購自成都昱強(qiáng)科技有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad 公司，凝膠電泳分析系統(tǒng)購自美國GENE公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理取人宮頸癌Hela細(xì)胞，置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清及鏈霉素和青霉素各100×103U·L-1的DMEM/F12中，于含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換液1次，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，然后在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞分為siRNA-FAK組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染FAK基因干擾序列：5′-CGCGTCGTAAATGCCTTGATGTACATCTTTGATATC-CGAGATGTACATCAAGGCATTTATTTTTTCCAAC-3′)、siRNA-陰性對(duì)照組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列：5′-CGCGTCGTCGAAGTACTCAGCGTAAGTTGATATCC-GCTTACGCTGAGTACTTCGATTTTTTCCAAC-3′)和空白對(duì)照組(細(xì)胞不作任何處理)。具體操作按LipofectamineTM2000試劑盒說明進(jìn)行。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測各組細(xì)胞中FAK基因表達(dá)取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，每組約5×103個(gè)細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，用TRIzol總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，檢測總RNA純度，取合格樣品，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為模板鏈cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR。FAK引物序列：上游為5′-CCCTGCTGACAGCTACAACG-3′，下游為5′-GCCCGTCACATTCTCGTACA-3′；β-actin引物序列：上游為5′-TTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′，下游為5′-ATCACAATGCCAGTGGTACG-3′。PCR反應(yīng)條件：第1個(gè)循環(huán)為95 ℃預(yù)變性5 min，接著行38個(gè)PCR循環(huán)：95 ℃變性30 s，60 ℃延伸30 s。每個(gè)樣品均設(shè)6個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。采用2-ΔΔCt法獲得各組細(xì)胞中FAK mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5MTT法檢測各組細(xì)胞增殖能力取各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化后接種于96孔板，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，各組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫箱培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)12、24、48、72、96 h 時(shí)，每孔加入5 g·L-1的MTT液20 μL，37 ℃孵育 4 h，每孔加入體積分?jǐn)?shù)0.5%的二甲基亞砜 200 μL，充分搖晃均勻后，利用全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀于490 nm處檢測各孔吸光度值。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，胰蛋白酶消化后接種于6孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，加入5 μmol·L-1的Annexin V標(biāo)記液5 μL，加入10 μmol·L-1的PI液 5 μL，室溫下避光孵育20 min，加入1×結(jié)合緩沖液，60 min內(nèi)上機(jī)檢測，每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，取均值。

1.7Transwell法檢測各組細(xì)胞遷移能力取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，胰蛋白酶消化后應(yīng)用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108L-1。取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室，將含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液置于小室下室，將Transwell小室置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。取出后，將上室內(nèi)散落的細(xì)胞去除，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗3次，用甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色15 min，PBS沖洗3次，倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)取10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.8Transwell法檢測各組細(xì)胞侵襲能力將 50 mg·L-1基質(zhì)膠按18稀釋后平鋪于Transwell小室上室，風(fēng)干后備用。用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108L-1。取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室，將含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液置于小室下室，將Transwell小室置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。取出后，將上室內(nèi)散落的細(xì)胞去除，PBS沖洗3次，用甲醛固定 20 min，結(jié)晶紫染色15 min，PBS沖洗3次，倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)取10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.9Westernblot法檢測各組細(xì)胞中FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，每組約 5×103個(gè)細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，用總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中總蛋白，利用Bradford法對(duì)各組蛋白濃度進(jìn)行檢測。取各組50 μg總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用脫脂奶粉封閉60 min，將各組細(xì)胞再次進(jìn)行分組，分別加入一抗兔抗人FAK多克隆抗體、Raf-1單克隆抗體、p-Raf-1抗體、MEK1/2多克隆抗體、p-MEK1/2多克隆抗體、ERK單克隆抗體、p-ERK多克隆抗體(稀釋比例分別為1500、11 200、11 000、1500、11 500、1800、11 000)，4 ℃過夜孵育，用洗膜緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)洗膜3次，加入二抗，孵育60 min，用TBST洗膜3次，加入ECL發(fā)光液，避光反應(yīng)15 min，曝光充分后拍照。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞中FAKmRNA表達(dá)比較空白對(duì)照組、siRNA-陰性對(duì)照組、siRNA-FAK組細(xì)胞中FAK mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.03±0.01、0.34±0.05，3組細(xì)胞中FAK mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=74.559，P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與siRNA-陰性對(duì)照組細(xì)胞中FAK mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白對(duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組比較，siRNA-FAK組細(xì)胞中FAK mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2各組細(xì)胞增殖能力比較結(jié)果見表1。培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)，空白對(duì)照組、siRNA-陰性對(duì)照組、siRNA-FAK組培養(yǎng)細(xì)胞增殖能力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.389、14.804、14.945、18.135，P<0.05)。培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)，空白對(duì)照組與siRNA-陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖能力比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)，siRNA-FAK組細(xì)胞增殖能力顯著低于空白對(duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1各組細(xì)胞細(xì)胞增殖能力比較

組別n細(xì)胞增殖能力24h48h72h96h空白對(duì)照組60．43±0．090．55±0．060．70±0．110．79±0．08siRNA?陰性對(duì)照組60．42±0．110．58±0．100．68±0．080．81±0．12siRNA?FAK組60．31±0．12ab0．40±0．08ab0．49±0．07ab0．58±0．10abF9．38914．80414．94518．135P0．0020．0000．0000．000

注：與空白對(duì)照組比較aP<0.05；與siRNA-陰性對(duì)照組比較bP<0.05。

2.3各組細(xì)胞凋亡率比較結(jié)果見圖1?？瞻讓?duì)照組、siRNA-陰性對(duì)照組、siRNA-FAK組細(xì)胞凋亡率分別為(7.2±1.8)%、(10.6±2.8)%、(16.6±3.8)%，3組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.884，P<0.05)?？瞻讓?duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白對(duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組比較，siRNA-FAK組細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：siRNA-FAK組；B：siRNA-陰性對(duì)照組；C：空白對(duì)照組。

圖1流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況

Fig.1Detectionofapoptosisbyflowcytometryineachgroup

2.4各組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較結(jié)果見表2、圖2和圖3。空白對(duì)照組、siRNA-陰性對(duì)照組、siRNA-FAK組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.301、20.598，P<0.05)?？瞻讓?duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白對(duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組比較，siRNA-FAK組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2各組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較

組別n遷移細(xì)胞數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)空白對(duì)照組6119．2±23．5130．7±12．9siRNA?陰性對(duì)照組6106．6±18．6131．0±13．9siRNA?FAK組667．6±12．6ab84．9±15．9abF12．30120．598P0．0010．000

注：與空白對(duì)照組比較aP<0.05；與siRNA-陰性對(duì)照組比較bP<0.05。

A：siRNA-FAK組；B：siRNA-陰性對(duì)照組；C：空白對(duì)照組。

圖2各組細(xì)胞遷移能力比較(結(jié)晶紫染色，×200)

Fig.2Comparisonofthecellmigrationabilityineachgroup(crystalvioletstaining，×200)

A：siRNA-FAK組；B：siRNA-陰性對(duì)照組；C：空白對(duì)照組。

圖3各組細(xì)胞侵襲能力比較(結(jié)晶紫染色，×200)

Fig.3Comparisonofthecellinvasionabilityineachgroup(crystalvioletstaining，×200)

2.5各組細(xì)胞中FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)比較結(jié)果見表3和圖4。空白對(duì)照組、siRNA-陰性對(duì)照組、siRNA-FAK組細(xì)胞中FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.032、12.063、16.684、9.143、31.464、8.443、32.585，P<0.05)?？瞻讓?duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組細(xì)胞中FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白對(duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組比較，siRNA-FAK組細(xì)胞中FAK、p-Raf-1、p-MEK1/2、p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，而Raf-1、MEK1/2和ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3各組細(xì)胞中FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)比較

組別nFAK蛋白R(shí)af?1蛋白p?Raf?1蛋白MEK1/2蛋白p?MEK1/2蛋白ERK蛋白p?ERK蛋白空白對(duì)照組60．75±0．100．36±0．060．77±0．200．32±0．080．67±0．120．51±0．210．62±0．09siRNA?陰性對(duì)照組60．80±0．070．44±0．140．65±0．120．33±0．050．66±0．120．44±0．060．67±0．04siRNA?FAK組60．30±0．09ab0．61±0．03ab0．31±0．08ab0．60±0．20ab0．27±0．02ab0．79±0．15ab0．40±0．04abF58．03212．06316．6849．14331．4648．44332．585P0．0000．0010．0000．0030．0000．0030．000

注：與空白對(duì)照組比較aP<0.05；與siRNA-陰性對(duì)照組比較bP<0.05。

圖4各組細(xì)胞中FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)(Westernblot)

Fig.4ExpressionsofFAK，Raf-1，p-Raf-1，MEK1/2，p-MEK1/2，ERKandp-ERKproteininthecellsineachgroup(Westernblot)

3 討論

宮頸癌為女性第2位高發(fā)惡性腫瘤，每年我國有2萬至3萬名婦女死于該病[4]，目前，臨床上尚無特效的治療手段，尤其是對(duì)于晚期出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者，預(yù)后多數(shù)不良[5]。有研究指出，宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力較強(qiáng)是導(dǎo)致患者預(yù)后較差的主要因素[6]。因此，積極探討宮頸癌增殖、遷移、侵襲的相關(guān)機(jī)制，對(duì)指導(dǎo)治療及改善患者預(yù)后具有重要意義。FAK主要存在于細(xì)胞質(zhì)，為一種具有酪氨酸激酶活性的激酶，是整合素分子信號(hào)通路下游重要因子，在整合素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[7]，與細(xì)胞增殖、生長、運(yùn)動(dòng)、凋亡等生物學(xué)功能密切相關(guān)[8]，F(xiàn)AK參與了腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移過程[9]。同時(shí)，F(xiàn)AK可通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而加速腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[10]。本研究利用siRNA技術(shù)特異性抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞中FAK基因，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與siRNA-陰性對(duì)照組細(xì)胞中FAK基因和蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而siRNA-FAK組細(xì)胞中的FAK基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組比較均顯著降低，提示Hela細(xì)胞中FAK基因表達(dá)被成功抑制。

本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組相比，培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)，siRNA-FAK組細(xì)胞增殖能力均顯著降低，說明特異性抑制Hela細(xì)胞中FAK基因可抑制細(xì)胞增殖能力，提示FAK基因參與了Hela細(xì)胞增殖過程。有研究指出，F(xiàn)AK基因激活可通過一系列信號(hào)傳導(dǎo)而促進(jìn)周期素D1、周期蛋白依賴性蛋白激酶大量表達(dá)，從而推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖[11]。李吉友等[12]研究指出，下調(diào)FAK基因表達(dá)可促進(jìn)人胃癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是抑制FAK可激活細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序而加速細(xì)胞凋亡發(fā)生。這些研究提示FAK基因可能在腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，有望為腫瘤分子治療提供新的靶點(diǎn)。本研究流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而siRNA-FAK組細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組比較顯著增加，說明特異性抑制Hela細(xì)胞中FAK基因可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

王軍等[13]指出，F(xiàn)RK可能通過抑制FAK的磷酸化來調(diào)控膠質(zhì)瘤的侵襲與遷移。阿力亞等[14]研究顯示，下調(diào)FAK表達(dá)可影響肝癌細(xì)胞黏附遷移侵襲能力，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)或活化而實(shí)現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而siRNA-FAK組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組比較均顯著降低，說明特異性抑制Hela細(xì)胞中FAK基因可抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力，提示FAK基因參與了宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲過程。

Raf/MEK/ERK作為ERK信號(hào)通路中的主要路徑，在細(xì)胞增殖、分化、惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用[15]，而該信號(hào)通路異常激活則與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過程有關(guān)，在腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[16]。有研究指出，Raf/MEK/ERK是整合素-FAK調(diào)控的主要信號(hào)通路之一，在細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核過程中發(fā)揮重要作用[17]。本研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組細(xì)胞FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與空白對(duì)照組和siRNA-陰性對(duì)照組比較，siRNA-FAK組p-Raf-1、p-MEK1/2、p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，而Raf-1、MEK1/2和ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，說明特異性抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞中FAK基因，可顯著抑制Raf/MEK/ERK信號(hào)活化，提示抑制FAK基因可能通過抑制Raf/MEK/ERK信號(hào)通路而減少細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，特異性抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞中FAK基因可減少細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞遷移和侵襲，其機(jī)制可能與抑制Raf/MEK/ERK信號(hào)通路有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] BRAZ N S，LORENZI N P，SORPRESO I C，etal.The acceptability of vaginal smear self-collection for screening for cervical cancer：a systematic review[J].Clinics，2017，72(3)：183-187.

[2] SHANTHI E，KRISHNA M H，ARUNESH G M，etal.Focal adhesion kinase inhibitors in the treatment of metastatic cancer：a patent review[J].ExpertOpinTherPat，2014，24(10)：1077-1100.

[3] LV P C，JIANG A Q，ZHANG W M，etal.FAK inhibitors in cancer，a patent review[J].ExpertOpinTherPat，2018，28(2)：139-145.

[4] 孫盼盼，劉莉，平智廣，等.不同地區(qū)癌癥發(fā)病分布特征及聚類分析[J].中國癌癥雜志，2016，26(6)：499-507.

[5] CHENG J，ZENG Z，YE Q，etal.The association of pretreatment thrombocytosis with prognosis and clinicopathological significance in cervical cancer：a systematic review and meta-analysis[J].Oncotarget，2017，8(15)：24327-24336.

[6] 吳向暉，黃鵬翀，秦海霞.miR-320靶向Rab11對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，34(10)：885-888，895.

[7] 于美沁，譚少健，陳瓊，等.去整合素kistrin干預(yù)兔后發(fā)性白內(nèi)障形成中晶狀體上皮細(xì)胞FAK及ERK基因表達(dá)的研究[J].眼科新進(jìn)展，2011，31(6)：504-507.

[8] LIU F，TONG D，LI H，etal.Bufalin enhances antitumor effect of paclitaxel on cervical tumorigenesis via inhibiting the integrin α2/β5/FAK signaling pathway[J].Oncotarget，2016，7(8)：8896-8907.

[9] BENZINA S，HARQUAIL J，GUERRETTE R，etal.Breast cancer malignant processes are regulated by pax-5 through the disruption of FAK signaling pathways[J].JCancer，2016，7(14)：2035-2044.

[10] 諸葛春鳳，劉詩權(quán)，譚林，等.SphK1和 FAK 對(duì)人結(jié)腸癌 HCT116細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響[J].中國病理生理雜志，2016，32(3)：439-444.

[11] FLINEER L I，WIER?D L，ROSSELAND C M，etal.FAK regulates Cdk2 in EGF-stimulated primary cultures of hepatocytes[J].JCellPhysiol，2013，228(6)：1304-1313.

[12] 李吉友，賈棟.抑制FAK的表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2017，25(1)：34-37.

[13] 王軍，石瓊，張春亭，等.FRK通過 FAK信號(hào)通路抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移與侵襲作用的研究[J].臨床神經(jīng)外科雜志，2016，13(4)：263-266，271.

[14] 阿力亞，胡文杰，彭寶崗，等.黏著斑激酶表達(dá)下調(diào)對(duì)肝癌細(xì)胞黏附遷移侵襲行為的影響[J].中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)：電子版，2016，10(2)：93-98.DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-0793.2016.02.002.

[15] SUN P，WANG L，LU Y，etal.MicroRNA-195 targets VEGFR2 and has a tumor suppressive role in ACHN cells via PI3K/Akt and Raf/MEK/ERK signaling pathways[J].IntJOncol，2016，49(3)：1155-1163.

[16] KARKHANIS M，PARK J I.Sp1 regulates Raf/MEK/ERK-induced p21(CIP1) transcription in TP53-mutated cancer cells[J].CellSignal，2015，27(3)：479-486.

[17] LI L，ZHAO G D，SHI Z，etal.The Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathway and its role in the occurrence and development of HCC[J].OncolLett，2016，12(5)：3045-3050.