劉亞坤，呂風(fēng)華，司澳洋，王 卓，吳 林

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝 453100；2.河南大學(xué)淮河醫(yī)院心內(nèi)科，河南 開封 475000)

心肌肥大是心肌對各種刺激產(chǎn)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)，其主要病理改變是心肌細胞表型變化、體積增大及蛋白質(zhì)合成增加。早期肥大有一定的代償意義，長期肥大則是引發(fā)多種心血管疾病和患者死亡的危險因素。目前，心肌肥大的機制尚未完全明確。骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)是一種分泌性多功能蛋白，是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β) 超家族的成員之一，在細胞的增殖、分化、遷移、凋亡方面發(fā)揮多種作用[1-2]。研究表明，BMP4可誘導(dǎo)病理性心肌肥大[3]，其具體機制仍在研究中。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)是膜受體信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑之一，參與細胞的生長代謝、增殖、分化、凋亡等多種生物過程。有研究報道，心臟過表達PI3K的小鼠表現(xiàn)為心肌細胞肥大，Akt可能是重要的下游效應(yīng)分子[4-5]。自噬是通過包裹待降解物形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要。研究發(fā)現(xiàn)，自噬與心肌肥大關(guān)系密切[6-8]，但具體作用機制說法不一，故探討自噬在心肌細胞中的作用對于闡明心肌肥大的分子機制具有一定指導(dǎo)意義。有研究證實，BMP4可能通過激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinases，ERK1/2)而誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細胞肥大[9]。本研究以大鼠H9c2細胞為對象，通過BMP4刺激，觀察心肌細胞中PI3K、Akt、自噬微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)、腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達，并探討PI3K-Akt通路和自噬在心肌細胞中的作用。

1 材料與方法

1.1細胞、試劑與儀器大鼠H9c2心肌細胞株(中國科學(xué)院上海細胞庫)，BMP4、PI3K-Akt抑制劑LY294002(美國PeproTech公司)，自噬抑制劑3MA(美國Selleckchem公司)，達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國Gibco公司)，2.5 g·L-1胰蛋白酶、青鏈霉素混合液(北京索萊寶公司)，蛋白磷酸酶抑制劑混合物、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium doecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、高靈敏度化學(xué)發(fā)光試劑盒、抗甘油醛3磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔多克隆抗體(北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司)，α-SMA抗體(美國Abcam公司)、腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)抗體(南京恩晶生物公司)，PI3K-Akt及磷酸化PI3K-Akt信號通路抗體、LC3抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，山羊抗鼠IgG、羊抗兔-IgG二抗(美國Jackson Immuno Research公司)；電轉(zhuǎn)移儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，Amersham Imager凝膠成像系統(tǒng)(美國通用電器公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組取H9c2細胞接種于含體積分數(shù)10% FBS的高糖培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長至約70%融合后用含體積分數(shù)1%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細胞同步化。實驗分2部分，第1部分不進行分組，取同步化細胞加50 μg·L-1BMP4 60 μL進行干預(yù)，分別在干預(yù)后0、1、4、8、12、24 h 測P-Akt蛋白表達；第2部分將同步化的心肌細胞隨機分為對照組、BMP4組、BMP4+LY294002組及BMP4+3MA組。對照組細胞應(yīng)用體積分數(shù)1%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)；BMP4組細胞應(yīng)用含50 μg·L-1BMP4的體積分數(shù)1%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)；BMP4+LY294002組細胞先應(yīng)用含25 μmol·L-1的LY294002預(yù)處理120 min，再以含50 μg·L-1BMP4的體積分數(shù)1%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)；BMP4+3MA組細胞先用含10 mmol·L-1的自噬抑制劑3MA預(yù)處理120 min，再以含50 μg·L-1BMP4的體積分數(shù)1%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組細胞在給予BMP4 1 h后檢測P-PI3K、P-Akt、LC3蛋白的表達，給予BMP4 48 h后檢測BNP、α-SMA蛋白的表達。

1.2.2Westernblot法檢測各組大鼠心肌細胞內(nèi)P-PI3K、P-Akt、LC3、α-SMA及BNP蛋白的表達提取各組細胞總蛋白，按體積比41加入緩沖液，于100 ℃下變性5 min；電泳(濃縮膠90 V，分離膠120 V)。電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜膜上(250 mA，80 min)，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(tris buffered saline tween，TBST)室溫封閉2 h；分別加入一抗α-SMA(15 000)、BNP(1100)、LC3(15 000)、PI3K(11 000)、P-PI3K(11 000)、P-Akt(11 000)、Akt(11 000)及GAPDH(110 000)，4 ℃過夜。TBST 洗膜3次，每次15 min，加入對應(yīng)二抗(15 000)，室溫孵育1 h。加入高靈敏化學(xué)發(fā)光劑，置入Amersham Imager凝膠成像系統(tǒng)，曝光。應(yīng)用Image J軟件分析目的蛋白條帶的灰度值。α-SMA、BNP以GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)化，LC3Ⅱ與LC3Ⅰ條帶的比值代表LC3蛋白表達水平，P-PI3K、P-Akt以PI3K、Akt進行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.3細胞表面積測量各組大鼠心肌細胞干預(yù)48 h后，倒置顯微鏡下拍照(×200)，每組觀察5個視野，每個視野隨機選取15個細胞，用Image J軟件測量細胞表面積，取均值。

1.2.4BCA法檢測各組大鼠心肌細胞總蛋白含量各組細胞干預(yù)至預(yù)定時間后，4 ℃下2 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，磷酸鹽緩沖液漂洗3次。將放射免疫沉淀分析蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑按991混勻后加入細胞中，輕輕吹打數(shù)次，冰上裂解1 h，4 ℃下12 000 r·min-1離心 20 min 取上清液，計算各組體積。以牛血清白蛋白(2 g·L-1)為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度。根據(jù)各組蛋白濃度、體積、細胞計數(shù)計算各組細胞中每個細胞的平均蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心肌細胞表面積及總蛋白含量比較結(jié)果見表1。BMP4組大鼠心肌細胞表面積及總蛋白含量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；BMP4+LY294002組與對照組大鼠心肌細胞表面積及總蛋白含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；BMP4+3MA組大鼠心肌細胞表面積大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，BMP4+3MA組與對照組大鼠心肌細胞總蛋白含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；BMP4+LY294002、BMP4+3MA組大鼠心肌細胞表面積及總蛋白含量均低于BMP4組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；BMP4+LY294002組與BMP4+3MA組大鼠心肌細胞表面積及總蛋白含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1各組大鼠心肌細胞表面積、蛋白含量比較

組別n細胞表面積/μm2總蛋白含量/pg對照組3274．27±52．56142．91±14．97BMP4組3593．73±53．72a214．21±19．22aBMP4+3MA組3356．33±47．73ab157．06±11．12bBMP4+LY294002組3256．41±51．31b134．73±13．83b

注：與對照組比較aP<0.01；與BMP4組比較bP<0.05。

2.2BMP4干預(yù)后不同時間大鼠心肌細胞內(nèi)P-Akt蛋白表達結(jié)果見圖1。BMP4作用于大鼠心肌細胞0、1、4、8、12、24 h后P-Akt蛋白相對表達量分別為0.56±0.02、0.92±0.12、0.42±0.10、0.63±0.11、0.64±0.23、0.29±0.08。BMP4作用于心肌細胞后P-Akt蛋白相對表達量隨時間出現(xiàn)先增高后降低的趨勢，1 h時達高峰，各時間點P-Akt蛋白相對表達量總體上比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.465，P<0.05)；BMP4作用于大鼠心肌細胞1 h時P-Akt蛋白相對表達量均高于其他時間點(P<0.05)。

圖1BMP4作用不同時間時大鼠心肌細胞內(nèi)P-Akt蛋白表達(Westernblot)

Fig.1ExpressionoftheP-AktproteinintheratscardiomyocyteatdifferenttimesofBMP4intervention(Westernblot)

2.3BMP4干預(yù)1h后各組大鼠心肌細胞內(nèi)P-PI3K、P-Akt及LC3蛋白表達結(jié)果見圖2、圖3、圖4和表2。BMP4組、BMP4+3MA組大鼠心肌細胞內(nèi)P-PI3K蛋白表達水平高于對照組，BMP4+LY294002組大鼠心肌細胞內(nèi)P-PI3K蛋白表達水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；BMP4+3MA組、BMP4+LY294002組大鼠心肌細胞內(nèi)P-PI3K蛋白表達水平低于BMP4組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，BMP4+LY294002組大鼠心肌細胞內(nèi)P-PI3K蛋白表達水平低于BMP4+3MA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。BMP4、BMP4+3MA組大鼠心肌細胞內(nèi)P-Akt蛋白及自噬相關(guān)蛋白LC3表達水平高于對照組(P<0.01)，BMP4+LY294002組與對照組大鼠心肌細胞內(nèi)P-Akt蛋白及自噬相關(guān)蛋白LC3表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；BMP4+3MA、BMP4+LY294002組大鼠心肌細胞內(nèi)P-Akt蛋白及自噬相關(guān)蛋白LC3表達水平低于BMP4組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；BMP4+3MA組與BMP4+LY294002組大鼠心肌細胞P-Akt蛋白及自噬相關(guān)蛋白LC3表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1：對照組；2：BMP4組；3：BMP4+3MA組；4：BMP4+LY294002組。

圖2BMP4干預(yù)大鼠心肌細胞1h后P-PI3K蛋白表達(Westernblot)

Fig.2ExpressionofP-PI3KproteinafterBMP4interventioninratscardiomyocytesfor1h(Westernblot)

1：對照組；2：BMP4組；3：BMP4+LY294002組；4：BMP4+3MA組。

圖3BMP4干預(yù)大鼠心肌細胞1h后P-Akt蛋白表達(Westernblot)

Fig.3ExpressionofP-AktproteinafterBMP4interventioninrtascardiomyocytesfor1h(Westernblot)

1：對照組；2：BMP4組；3：BMP4+3MA組；4：BMP4+LY294002組。

圖4各組大鼠心肌細胞自噬相關(guān)蛋白LC3表達(Westernblot)

Fig.4ExpressionofautophagyrelatedproteinLC3inratscardiomyocytesineachgroup(Westernblot)

表2BMP4干預(yù)1h后各組大鼠心肌細胞內(nèi)P-PI3K及P-Akt蛋白表達比較

組別nP?PI3K蛋白P?Akt蛋白LC3對照組30．56±0．060．83±0．271．53±0．21BMP4組30．88±0．10a1．84±0．24a3．27±0．32aBMP4+3MA組30．73±0．21ab1．21±0．17ab2．28±0．40abBMP4+LY294002組30．38±0．11abc0．96±0．34b1．77±0．52bF25．09127．03028．212P0．0210．0360．020

注：與對照組比較aP<0.01；與BMP4組比較bP<0.05；與BMP4+3MA組比較cP<0.05。

2.4BMP4作用48h后各組大鼠心肌細胞內(nèi)α-SMA和BNP蛋白表達結(jié)果見圖5和表3。BMP4組大鼠心肌細胞內(nèi)α-SMA蛋白表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；BMP4+3MA、BMP4+LY294002組大鼠心肌細胞內(nèi)α-SMA蛋白表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；BMP4+3MA組、BMP4+LY294002組大鼠心肌細胞內(nèi)α-SMA蛋白表達水平低于BMP4組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，BMP4+3MA組大鼠心肌細胞內(nèi)α-SMA蛋白表達水平高于BMP4+LY294002組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。BMP4、BMP4+3MA組大鼠心肌細胞內(nèi)BNP蛋白表達水平高于對照組(P<0.01)，BMP4+LY294002組大鼠心肌細胞內(nèi)BNP蛋白表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；BMP4+3MA、BMP4+LY294002組大鼠心肌細胞內(nèi)BNP蛋白表達水平低于BMP4組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

1：對照組；2：BMP4組；3：BMP4+LY294002組；4：BMP4+3MA組。

圖5各組大鼠心肌細胞內(nèi)α-SMA和BNP蛋白表達(Westernblot)

Fig.5Expressionofα-SMAandBNPproteininratscardiomyocytesineachgroup(Westernblot)

表3BMP4作用48h后各組大鼠心肌細胞內(nèi)α-SMA及BNP蛋白表達比較

組別nα?SMA蛋白BNP蛋白對照組30．97±0．080．53±0．05BMP4組31．61±0．06a1．45±0．12aBMP4+3MA組31．32±0．24b0．74±0．08abBMP4+LY294002組30．58±0．24bc0．45±0．09bF28．35178．468P0．0090．018

注：與對照組比較aP<0.01；與BMP4組比較bP<0.05；與BMP4+3MA組比較cP<0.05。

3 討論

心肌肥大是多種心血管疾病發(fā)展到一定階段的病理過程，已被公認為是猝死、心律失常等心血管事件的獨立危險因素。心肌肥大的本質(zhì)是核內(nèi)基因表達改變，如β-肌球蛋白重鏈、SMA、心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)等基因的表達上調(diào)。因此，探討其發(fā)生的病理生理機制，尋找心肌肥大的潛在靶點，對于改善心肌功能及心血管疾病的治療有重要意義。多種因素均可誘導(dǎo)心肌肥大的發(fā)生，如機械應(yīng)激和神經(jīng)體液因子、容量及壓力負荷的增加、炎癥刺激等[10]。BMP4是TGF-β超家族中的一員，最早由OZKAYNAK等[11]從牛成骨蛋白提取物中分離出來，在軟骨、骨的形成和修復(fù)過程中有獨特的誘導(dǎo)活性。SUN等[3]研究發(fā)現(xiàn)，BMP4能誘發(fā)病理性心肌肥大，在壓力負荷構(gòu)建的病理性心肌肥大模型中BMP4及心肌肥大標(biāo)志物ANP、BNP表達增加，而在游泳訓(xùn)練導(dǎo)致的生理性肥大小鼠模型中BMP4、ANP及BNP的表達未見明顯改變。本研究發(fā)現(xiàn)，用50 μg·L-1BMP4刺激大鼠心肌細胞后，BMP4組心肌細胞的細胞表面積明顯大于不給予BMP4刺激的對照組，總蛋白含量也高于對照組；同時，BNP、α-SMA表達也高于對照組。而BMP4+LY294002、BMP4+3MA組心肌細胞的細胞表面積、總蛋白含量、BNP表達少于BMP4組。說明LY294002、3MA在一定程度上抑制了心肌肥大的發(fā)生。

PI3K-Akt通路是膜受體信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，可介導(dǎo)細胞的生長、增殖和分化。PI3K是一種細胞內(nèi)蛋白激酶，其是由1個催化亞基p110和1個調(diào)節(jié)亞基p85構(gòu)成的異源二聚體。Akt屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是一種相對分子量為60 000的蛋白質(zhì)。無活性的調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110復(fù)合物存在于細胞質(zhì)，當(dāng)受到某些刺激激活后在細胞膜上生成第2信使PIP3，PIP3可使下游分子Akt磷酸化，進一步發(fā)揮生物學(xué)功能[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠心臟過表達活性PI3K可引起心肌細胞體積增大，Akt可能是重要的下游效應(yīng)分子[4]。PI3K-Akt通路的激活及P-PI3K、P-Akt蛋白表達的增高可能是心肌肥厚發(fā)生的機制[5]。WU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，BMP4可通過激活PI3K-Akt通路而減少肺動脈平滑肌細胞凋亡。本研究以50 μg·L-1BMP4刺激大鼠心肌細胞不同時間后發(fā)現(xiàn)，P-Akt蛋白表達在1 h達到高峰，隨后呈下降趨勢。同時還發(fā)現(xiàn)，BMP4作用于大鼠心肌細胞1 h時，BMP4組大鼠心肌細胞內(nèi)P-PI3K、P-Akt蛋白表達水平明顯高于對照組，而BMP4+LY294002組大鼠心肌細胞內(nèi)P-PI3K、P-Akt蛋白表達變化不明顯，提示BMP4可能是在早期通過激活PI3K-Akt通路而誘導(dǎo)心肌細胞肥大。

自噬的主要生理功能是將胞質(zhì)中的大分子物質(zhì)和一些細胞內(nèi)源性底物在單位膜包裹的囊泡中大量降解，實現(xiàn)再循環(huán)，以維持內(nèi)環(huán)境自身的穩(wěn)定。自噬在維持心肌細胞大小、結(jié)構(gòu)和功能等方面發(fā)揮重要作用[15-16]。有研究表明，心肌肥大和心臟衰竭中自噬增加[17]。NAKAI等[6]研究表明，自噬基因Atg7敲除后大鼠心肌細胞進一步肥大，提示抑制自噬可能誘導(dǎo)心肌細胞肥大。而ZHU等[7]采用主動脈縮窄法建立了心力衰竭小鼠模型，結(jié)果顯示，病理狀態(tài)下心肌細胞自噬能誘導(dǎo)細胞肥大，在心肌缺血再灌注時能夠誘導(dǎo)心肌細胞自噬，從而增加對心肌的保護作用，因此，在不同誘導(dǎo)因素及心肌肥大的不同階段，自噬發(fā)揮的作用可能不同，具體機制仍待進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，在BMP4誘導(dǎo)大鼠心肌細胞肥大的過程中自噬活性增加，自噬相關(guān)蛋白LC3表達水平明顯增高。BMP4+3MA組大鼠心肌細胞內(nèi)LC3蛋白表達降低，自噬活性降低，該組大鼠心肌細胞表面積及BNP表達較BMP4組少，提示BMP4可能通過激活自噬而誘導(dǎo)心肌肥大。

BMP4誘導(dǎo)大鼠心肌細胞肥大可能與激活PI3K-Akt信號通路有關(guān)，而特異性抑制劑LY294002可減弱BMP4誘導(dǎo)的心肌肥大。同時，心肌肥大中的自噬受到激活，而抑制自噬可以減少心肌肥大的發(fā)展，提示自噬可能也是BMP4誘導(dǎo)心肌肥大的一個因素。本研究在一定程度上豐富了心肌肥大的分子機制，為臨床提供一定的理論基礎(chǔ)，也為心肌肥大的預(yù)防及治療提供新的方向。

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