李建鑫，朱曉龍，蘇景良，李建偉，梁海乾，孫洪濤

(中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科中心，天津 300162)

顱腦創(chuàng)傷(TBI)具有發(fā)病急驟，高致死率和高致殘率的特點。為更好研究TBI的發(fā)病機制及治療方案，涌現(xiàn)出了許多體外損傷模型[1]。神經(jīng)牽張損傷體外模型可以準(zhǔn)確的模擬TBI后的細胞改變，為我們更精確的研究神經(jīng)損傷的機制以及并探索可能的治療方案。近年來，有研究[2]顯示，某些肽類激素，在大量的基礎(chǔ)研究中表現(xiàn)出神經(jīng)保護性潛能。因此，外源性的給予這些天然肽類激素作為治療性藥物治療神經(jīng)損傷可能是潛在的治療新策略。胰高血糖素已被證實具備神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護特性。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)及受體在人體分布廣泛且療效多樣。除治療糖尿病外，GLP-1 受體激動劑在神經(jīng)系統(tǒng)均能發(fā)揮良好的神經(jīng)保護作用[3]。利拉魯肽是天然GLP-1 的長效類似物，它對多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)退行性疾病具有神經(jīng)保護作用[4]，但對TBI的作用尚不清楚。本實驗通過可控的氣體沖擊制備TBI牽張損傷模型，然后給予利拉魯肽處理，通過檢測細胞活力、細胞毒性和細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達，研究利拉魯肽對細胞牽張損傷神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SH-SY5Y細胞株購自上海然泰生物科技有限公司；Bcl-2、Bax及Caspase-3多克隆抗體均購自美國cell signaling公司；內(nèi)參抗體β-actin和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自碧云天生物技術(shù)研究所；I型膠原蛋白購自Sigma公司；BioFlex細胞培養(yǎng)板購于世聯(lián)博研科技有限公司；細胞損傷控制器Ⅱ(CIC-Ⅱ)購于弗吉尼亞大學(xué)；利拉魯肽購自吉爾生化(上海)有限公司；細胞毒性檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 SH-SY5Y細胞系的培養(yǎng) 將SH-SY5Y貼壁生長的細胞株常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2孵育箱中，培養(yǎng)基為DMEM/F12(1∶1)完全培養(yǎng)基，內(nèi)含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 u/mL硫酸鏈霉素。細胞密度達到70%～80%時，傳代或用于實驗。

1.3 MTT法檢測細胞活力 MTT法觀察利拉魯肽對SH-SY5Y細胞活力的影響。將培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞胰酶消化后以2×104/mL密度接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后，無血清誘導(dǎo)細胞分化12 h后，對照組給予等量的利拉魯肽藥物溶劑；利拉魯肽組給予1 μM利拉魯肽預(yù)處理24 h。每孔加入MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h后每孔加入三聯(lián)溶解液。溫箱孵育12 h，用酶標(biāo)儀檢測560 nm波長處各孔吸光度值(OD值)。

1.4 LDH法檢測細胞毒性 取第2代培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞，胰酶消化后以3×105/mL接種于Bioflex細胞培養(yǎng)板(I型膠原包被)中，培養(yǎng)48 h，待細胞匯合度達80%時，實驗分為3組，對照組、細胞損傷組以及利拉魯肽治療組。對照組給予等量的利拉魯肽藥物溶劑；細胞損傷組將Bioflex細胞培養(yǎng)板與CIC-Ⅱ細胞損傷控制器相連接，控制器將氣體脈沖傳送至與密閉的系統(tǒng)緊密連接的BioFlex細胞培養(yǎng)板。裝置上的閥門和計時器可精確控制閥門開放和氣體脈沖時間。通過調(diào)節(jié)裝置的壓力調(diào)節(jié)器可調(diào)節(jié)控制閥門的氣體脈沖壓力大小。當(dāng)氣體觸發(fā)后會引起培養(yǎng)板上的硅膠膜快速變形和回彈，從而造成粘附于硅膠膜上的SH-SY5Y細胞損傷，該實驗設(shè)定計量閥門壓力為18 PSI(磅每平方英寸)，此時氣體脈沖壓力1.8～2.0 PSI，制備輕度損傷細胞模型；利拉魯肽治療組是將輕度損傷的細胞加入1 μM利拉魯肽處理24 h。分別取對照組，損傷組和利拉魯肽治療組培養(yǎng)上清液100 μL，嚴(yán)格按照LDH檢測試劑盒說明進行實驗操作，采用酶標(biāo)儀440 nm波長處測定樣品吸光度。

1.5 蛋白免疫印跡檢測利拉魯肽對SH-SY5Y細胞的神經(jīng)保護作用 取第2代培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞，胰酶消化后以3×105/mL接種于Bioflex細胞培養(yǎng)板(I型膠原包被)培養(yǎng)48 h，待細胞匯合度達80%時，實驗分為3組，對照組、細胞損傷組以及利拉魯肽治療組。24 h后取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，加入RIPA 裂解液，離心收集上清，BCA法測蛋白濃度，加入上樣緩沖液(Loading buffer)后變性。于10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，每組上樣量為18 μg，將蛋白轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜上，2%脫脂奶粉封閉60 min，Bax(1∶800稀釋)、Bcl-2(1∶1000稀釋)和Caspase-3(1∶600稀釋)于4 ℃孵育過夜。次日，HRP標(biāo)記的二抗室溫搖床孵育 2 h，滴加 ECL 發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)中顯影。以β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 利拉魯肽能促進SH-SY5Y細胞增殖 為了摸索利拉魯肽適宜的保護性作用濃度，本研究采用改良型MTT法檢測并分析細胞的生長和存活情況。本實驗分別給予SH-SY5Y細胞不同濃度利拉魯肽處理(0.1 μM、1 μM和10 μM)。檢測結(jié)果顯示，利拉魯肽組比對照組細胞活力顯著提升，適宜保護性濃度為1 μM(F=5.931，P<0.05)(見表1)。

表1 不同濃度的利拉魯肽對SH-SY5Y細胞存活率

注：與對照組比較，aP<0.05

2.2 利拉魯肽能夠減輕細胞損傷引起的LDH的釋放水平 采用LDH試劑盒檢測不同處理組中LDH漏出率，進而了解各處理組的細胞毒性。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，細胞損傷組LDH釋放水平明顯提升，而利拉魯肽治療組LDH釋放水平降低(F=10.41，P<0.05)，提示利拉魯肽減輕了機械牽張誘導(dǎo)的細胞損傷(見表2)。

表2 不同處理組LDH釋放水平

注：與細胞損傷組比較，aP<0.05

2.3 利拉魯肽可以減輕細胞損傷誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞凋亡

2.3.1 利拉魯肽可減少促調(diào)亡蛋白Bax的表達并増加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達 Bax是Bcl-2家族中研究最廣泛的促調(diào)亡蛋白，當(dāng)細胞內(nèi)Bcl-2較多時，調(diào)亡趨勢減弱；當(dāng)細胞內(nèi)Bax增多時，則Bax形成的同源二聚體占主導(dǎo)則易發(fā)生凋亡。Bcl-2/Bax比值對決定細胞是否進入調(diào)亡狀態(tài)有重要意義。本實驗采用蛋白免疫印跡法檢測各處理組Bax以及Bcl-2的表達。結(jié)果顯示細胞牽張損傷組Bax蛋白的表達較對照組明顯增多，Bcl-2蛋白表達減少；利拉魯肽處理組Bax蛋白表達較牽張損傷組明顯降低(F=10.49，P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達明顯增高(F=19.58，P<0.01)(見圖1，表3)。

圖1 三組的Bax、Bcl-2和β-actin蛋白的表達

組別BaxBcl?2Caspase?3(OD)對照組0．25±0．080．43±0．060．67±0．08細胞損傷組0．52±0．090．17±0．031．21±0．63利拉魯肽組0．24±0．09a0．31±0．06b0．97±0．09a

注：利拉魯肽組與細胞損傷組比較，aP<0.05，bP<0.01

2.3.2 利拉魯肽可減少Caspase-3的表達 Caspase家族在細胞調(diào)亡過程中起非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵執(zhí)行分子。為檢測利拉魯肽在細胞牽張損傷中的抗調(diào)亡作用，采用蛋白免疫印跡檢測各組中Caspase-3的表達(見圖2)。如圖所示細胞牽張損傷組Caspase-3表達明顯增多，而利拉魯肽組Caspase-3的表達顯著降低(F=10.05，P<0.05)。

圖2 三組的Caspase-3和β-actin蛋白的表達

3 討論

TBI是臨床上常見的高致殘性損傷，因TBI給家庭和社會每年都造成巨大的經(jīng)濟負擔(dān)[5]。為更好研究TBI的發(fā)病機制及藥物干預(yù)治療，相繼出現(xiàn)了許多TBI體外模型(如壓迫損傷模型、氣壓損傷模型)，然而這些模型均無法準(zhǔn)確、真實的模擬臨床機械損傷作用力，無法滿足實驗檢測的需求。細胞牽張損傷模型可以更加準(zhǔn)確的模擬TBI的致傷作用力[6]，減少影響實驗結(jié)果的混淆因素，簡單可行。本實驗我們利用細胞損傷裝置-Ⅱ建立了SH-SY5Y細胞培養(yǎng)牽張損傷模型。此模型可以同時對細胞造成相對一致的損傷。本實驗細胞損傷模型，更接近于人體顱腦損傷的狀態(tài)，可在細胞和分子水平為我們提供損傷病理過程中的一系列重要信息，對了解TBI的病理生理機制具有重要作用。

雖然對于TBI的神經(jīng)保護方面的研究已取得巨大進展，但目前臨床上仍缺乏一種切實有效的藥物。這可能與TBI復(fù)雜的病理生理機制有關(guān)，這也成為影響患者治療與預(yù)后的主要難題。因此，尋找一種對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用，達到治療或延緩疾病進展的藥物尤為重要。

2型糖尿病已經(jīng)被認(rèn)為是神經(jīng)退行性性疾病的危險因素。大腦中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胰島素信號受損及胰島素受體脫敏現(xiàn)象。基于兩者具有共同發(fā)病機制，已有部分糖尿病治療藥物用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面的研究。GLP-1是一種促胰島素激素肽，被用于治療2型糖尿病[7-8]。近年來研究顯示，除胰腺外，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在大量的GLP-1受體。其受體分布的廣泛性決定了其生物學(xué)作用的多樣性。GLP-1受體激動劑對神經(jīng)系統(tǒng)的保護及治療作用已被越來越多的研究所證實。Kimura等研究顯示GLP-1受體激動劑可以刺激神經(jīng)生長因子的PC12細胞神經(jīng)突的生長、增強神經(jīng)細胞的分化并改善細胞生存率[9]；GLP-1類似物的艾塞那肽在大鼠短暫大腦中動脈閉塞模型中顯示出良好神經(jīng)保護作用[10]。有研究成果表明，GLP-1可以保護神經(jīng)元突觸可塑性[11]。另外，因GLP-1 受體激動劑能通過血-腦脊液屏障直接與其受體結(jié)合，發(fā)揮神經(jīng)保護作用被應(yīng)用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默病[12]、帕金森病[13]等神經(jīng)退行性疾病。

利拉魯肽是天然GLP-1的長效類似物，藥理活性與GLP-1相似，主要用于治療2型糖尿病[14]。利拉魯肽與GLP-1有97%的同源性，既具有相似的生理作用，又不易被降解。由于利拉魯肽的特異性受體在大腦中廣泛分布，近年來，利拉魯肽的神經(jīng)保護作用被越來越多的學(xué)者重視[15]。2014年，GLP-1類似物利拉魯肽首次被用于神經(jīng)退行性疾病的相關(guān)臨床試驗研究。它作為一種人源性的GLP-1受體激動劑，較天然的GLP-1更穩(wěn)定，可以通過血腦屏障，可促進神經(jīng)元增殖，對阿爾茨海默病具有神經(jīng)保護作用[16]。還有研究表明利拉魯肽通過靶定自噬在β細胞凋亡中起重要作用[17]。因此，我們認(rèn)為利拉魯肽在細胞損傷中的保護作用與抑制細胞凋亡有密切的關(guān)系。

TBI導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)可引起多種促凋亡因子的釋放，激活下游凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，最終導(dǎo)致細胞凋亡[18]。目前大體上講，凋亡的通路分為Caspases依賴型和Caspases非依賴型兩種。本研究通過蛋白免疫印跡法檢測各組凋亡蛋白Caspase-3的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞牽張損傷后，細胞凋亡明顯增加，Caspase-3 表達也增高，而利拉魯肽處理后，Caspase-3表達明顯降低。

Caspases依賴型和Caspases非依賴型凋亡均由B細胞淋巴瘤-2家族蛋白(Bcl-2)調(diào)控。Bcl-2基因家族在細胞凋亡的發(fā)生中構(gòu)成一個相互作用、相互制約的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax的平衡在凋亡發(fā)生過程中發(fā)揮著極其重要的作用[19]。Bcl-2具有抑制細胞凋亡的作用，且基因表達量與細胞凋亡程度成正比，而Bax則作為Bcl-2 家族中最重要的促凋亡基因。因此，Bcl-2過量表達可降低細胞凋亡，Bax過量表達則可增強細胞凋亡。所以，藥物可通過干預(yù)Bcl-2和Bax的表達達到抑制或者促進細胞凋亡的目的。本研究以細胞損傷控制器牽張損傷SH-SY5Y細胞來模擬顱腦創(chuàng)傷的體外模型，探討利拉魯肽是否對TBI細胞模型具有神經(jīng)保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽處理組，Bcl-2表達明顯增高，而Bax表達下調(diào)，提示利拉魯肽可以抑制細胞牽張損傷后細胞凋亡。

LDH是存在于機體各組織細胞內(nèi)的一種糖酵解酶。當(dāng)細胞凋亡或壞死后，細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致細胞內(nèi)的LDH釋放出來。因此測定LDH釋放率可以反映細胞損傷的情況。本實驗結(jié)果表明，細胞牽張損傷后SH-SY5Y 細胞LDH大量釋放，而利拉魯肽處理后，細胞LDH 的釋放率明顯降低。

綜上所述，利拉魯肽具有抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用，其可能機制還需進一步探索。本研究肯定了利拉魯肽對TBI細胞牽張損傷模型的神經(jīng)保護作用并為其向臨床轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)，并提示利拉魯肽干預(yù)可能成為未來治療TBI的新方法。

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