李秋園，代淑梅，楊 明

（中溶科技股份有限公司研發(fā)中心，河北省非糧乙醇工程技術(shù)研究中心，河北 唐山 064000）

目前，世界各國(guó)都在積極研究利用非糧手段生產(chǎn)生物燃料，用以解決日益嚴(yán)重的能源危機(jī)、氣候問題以及糧食短缺問題。木質(zhì)纖維素作為地球上儲(chǔ)量最豐富的多糖類物質(zhì)，利用其生產(chǎn)燃料乙醇已成為各國(guó)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[1-5]。但由于木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)致密復(fù)雜，大多數(shù)微生物并不能將其作為直接碳源來生產(chǎn)乙醇，只有將其水解成可發(fā)酵單糖類物質(zhì)后，才能被微生物利用[6-8]。酶解法由于其反應(yīng)條件溫和、效率高、能耗低、選擇性強(qiáng)以及環(huán)保效果好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于纖維素水解過程中[9-10]。但由于纖維素酶體系復(fù)雜，加大了從發(fā)酵液中分離提取較高純度的纖維素酶的難度，目前文獻(xiàn)報(bào)道的纖維素酶提取工藝大多是為了獲得純纖維素酶組分并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究，其工藝很難在工業(yè)中進(jìn)行應(yīng)用。在傳統(tǒng)的酶粗提方法中，鹽析法過程溫和，不會(huì)使酶分子發(fā)生變性，硫酸銨由于其具有較強(qiáng)的鹽析能力、較高的水溶性以及較低的溫度系數(shù)，因此在蛋白質(zhì)及酶的鹽析過程中常被使用[11]；但鹽析過程適合小規(guī)模酶的分離提取過程，而當(dāng)生產(chǎn)規(guī)模較大時(shí)，由于需要大量的無機(jī)鹽，會(huì)對(duì)后續(xù)環(huán)保處理帶來較大壓力；而膜分離過程不需要添加化學(xué)試劑，而且整個(gè)過程溫和，不會(huì)造成酶分子的變性失活，當(dāng)然，膜分離過程也存在投資成本偏高，膜易堵塞等問題。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中可根據(jù)需要選擇適宜的工藝路線。本試驗(yàn)對(duì)纖維素酶的分離提取工藝中的鹽析工藝路線和膜分離路線均進(jìn)行了研究，并在纖維素酶的粗分離基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行了凝膠色譜分離，使其滿足生產(chǎn)需要，以期對(duì)纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

里氏木霉（Trichoderma reesei）：中溶科技股份有限公司研發(fā)中心保藏。

硫酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

0.22 μm微濾膜、截留分子質(zhì)量分別為6×104Da中空纖維超濾膜（記為膜1）和1×104Da中空纖維超濾膜（記為膜2）（膜面積均為1.2 m2，最大操作壓力均為0.065 MPa）：合肥信達(dá)膜科技有限公司；KU-T5紫外可見分光光度計(jì)：南京肯凡電子科技有限公司；FA2004電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SHY-2A水浴恒溫振蕩器：江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；PHS-3C精密酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；G-75凝膠色譜：北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司。YZ1515X蠕動(dòng)泵：保定蘭格恒流泵有限公司；HD-21-88紫外檢測(cè)儀：上海淇特分析儀器有限公司；N2000雙通道色譜工作站：浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)：上海利聞科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 纖維素酶發(fā)酵液制備及預(yù)處理方法

利用實(shí)驗(yàn)室保藏的里氏木霉（Trichoderma reesei）菌種制備纖維素酶發(fā)酵液，所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[12]中纖維素酶的制備方法進(jìn)行。將所得發(fā)酵液經(jīng)過0.22μm微濾膜除去菌體及固形物，收集濾液，備用。

1.3.2 纖維素酶液的（NH4）2SO4鹽析處理

向經(jīng)過預(yù)處理的纖維素酶液中緩慢加入（NH4）2SO4，邊加邊攪拌，使（NH4）2SO4充分溶解，并使其飽和度分別達(dá)到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，充分?jǐn)嚢?，將其置?℃冰箱中冷藏過夜；然后于5 000 r/min離心10 min，收集上清液，測(cè)定上清液中纖維素酶活性和蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)將沉淀進(jìn)行冷凍干燥并稱質(zhì)量，測(cè)定沉淀中纖維素酶活性和蛋白質(zhì)濃度，并計(jì)算酶活收率和純化倍數(shù)。

1.3.3 纖維素酶液的二級(jí)超濾分離

在室溫條件下，將經(jīng)過預(yù)處理的纖維素酶液首先以不同的操作壓力（0.01 MPa、0.02 MPa、0.03 MPa、0.04 MPa、0.05 MPa、0.06 MPa）通過截留分子質(zhì)量為6×104Da的超濾膜（記為膜1），收集透過液，計(jì)算膜通量并測(cè)定透過液中纖維素酶活性；再將透過液以不同的操作壓力流過截留分子質(zhì)量為1×104Da的超濾膜（記為膜2），收集截留液，計(jì)算膜通量及測(cè)定截留液中纖維素酶活性。膜通量計(jì)算公式如下：

1.3.4 G-75凝膠色譜層析法

將經(jīng)過二級(jí)鹽析和二級(jí)超濾的纖維素酶進(jìn)行冷凍干燥，分別用0.2 mol/L pH7.4的磷酸緩沖液溶解，使纖維素酶溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，以0.5柱體積（bed volume，BV）的上樣量進(jìn)行G-75凝膠色譜層析，用0.2 mol/L pH7.4的磷酸緩沖液以1.0 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，收集各洗脫峰，測(cè)定各洗脫峰的纖維素酶活性，將具有纖維素酶活性的洗脫峰合并，并將其冷凍干燥，測(cè)定其纖維素酶活性，計(jì)算纖維素酶活收率及純化倍數(shù)。

1.3.5 纖維素酶活性測(cè)定方法

參考中華人民共和國(guó)能源行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NB/T 13005—2016《用于生物燃料乙醇制備的纖維素酶酶活力測(cè)定方法》[13]中規(guī)定的方法測(cè)定纖維素酶活力。

1.3.6 檢測(cè)方法

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)法[14]。

纖維素酶活收率、純化倍數(shù)、蛋白質(zhì)濃度比計(jì)算公式[15]如下：

式中：U1、U2為分離前、后纖維素酶液中纖維素酶活性，U/mL；V1、V2為分離前、后酶液體積，mL；m1、m2為分離前后纖維素酶液冷凍干燥后酶粉的質(zhì)量，g；P2為分離后纖維素酶粉中纖蛋白質(zhì)含量，mg/g。

總酶活收率為各步分離純化的酶活收率乘積；總純化倍數(shù)為各步分離純化的純化倍數(shù)乘積。

2 結(jié)果與分析

2.1 （NH4）2SO4鹽析飽和度的確定

向預(yù)處理后的纖維素酶液中加入（NH4）2SO4，使之達(dá)到不同的飽和度，沉淀之后分別測(cè)定上清液和沉淀中蛋白質(zhì)濃度和纖維素酶活性，結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1 上清液和沉淀中纖維素酶活性隨(NH4)2SO4飽和度的變化Fig.1 Changes of cellulase activity in supernatant and precipitate with saturation level of(NH4)2SO4

由圖1可知，當(dāng)（NH4）2SO4飽和度在0～20%范圍內(nèi)時(shí)，上清液和沉淀中纖維素酶活性變化不大，沉淀中纖維素酶活性很低，說明纖維素酶僅有很少量的沉淀，而圖2顯示在此飽和度范圍內(nèi)，上清液中蛋白質(zhì)含量逐漸下降，沉淀中蛋白質(zhì)含量逐漸增大，可能是預(yù)處理后纖維素酶液中有部分雜蛋白發(fā)生了沉淀；當(dāng)（NH4）2SO4飽和度在20%～80%范圍內(nèi)時(shí)，隨著（NH4）2SO4飽和度的增大，上清液中纖維素酶活性急劇下降，沉淀中纖維素酶活性迅速增大，其蛋白質(zhì)濃度的變化趨勢(shì)與其相似，當(dāng)（NH4）2SO4飽和度＞80%時(shí)，上清液中蛋白質(zhì)濃度繼續(xù)下降，沉淀中蛋白質(zhì)濃度持續(xù)增加，但此時(shí)上清液和沉淀中的纖維素酶活性變化較小，說明上清液中的纖維素酶已幾乎完全沉淀。因此，選擇向預(yù)處理后的纖維素酶液中初始加入20%飽和度的（NH4）2SO4，可使部分雜蛋白沉淀，再將（NH4）2SO4飽和度增加至80%，使上清液中的纖維素酶沉淀，此過程即為（NH4）2SO4二級(jí)鹽析過程，該過程不僅能使纖維素酶得到濃縮，而且能去除部分雜蛋白，經(jīng)計(jì)算，該過程纖維素酶純化倍數(shù)為4.28，纖維素酶活收率為95.50%。

圖2 上清液和沉淀中蛋白質(zhì)含量隨(NH4)2SO4飽和度的變化Fig.2 Changes of protein concentration in supernatant and precipitate with the saturation level of(NH4)2SO4

2.2 操作壓力對(duì)超濾膜通量的影響

將預(yù)處理后的纖維素酶液以不同的操作壓力通過膜1和膜2，其膜通量隨操作壓力的變化曲線如圖3所示。

圖3 操作壓力對(duì)超濾膜通量的影響Fig.3 Effect of operating pressure on the flux of ultrafiltration membrane

由圖3可知，隨著操作壓力（P）的增大，兩個(gè)膜的膜通量（Q1和Q2）均呈增加的趨勢(shì)，且膜通量與操作壓力呈正相關(guān)，對(duì)其線性回歸方程擬合為：Q1=1 004.90P1，相關(guān)系數(shù)R2=0.972 2；Q2=747.25P2，R2=0.997 5。在相同的操作壓力下，膜2的膜通量均大于膜1，這是由于預(yù)處理后的纖維素酶液首先通過膜1，在此過程中能除去體系中的部分雜蛋白和其他雜質(zhì)成分，使得通過膜2的纖維素酶液中雜質(zhì)含量較少，故在相同的操作壓力下，膜2較膜1具有較高的通量。由于本實(shí)驗(yàn)所選的中空纖維膜的最高操作壓力為0.065MPa，考慮到膜的使用壽命及工業(yè)生產(chǎn)對(duì)高通量的要求，選擇0.050 MPa為膜1的操作壓力，膜1的膜通量為37.362 mL/（min·m2），由于纖維素酶液的二級(jí)超濾過程為連續(xù)過程，故膜1和膜2具有相同的膜通量，因此，當(dāng)膜2的膜通量為37.362 mL/（min·m2）時(shí)，由擬合方程可知其對(duì)應(yīng)的操作壓力為0.037 MPa。因此對(duì)于經(jīng)過預(yù)處理后的纖維素酶液，首先以0.050 MPa的操作壓力通過膜1，收集濾過夜，再以0.037 MPa的操作壓力通過膜2，收集截留液，此截留液即為經(jīng)過二級(jí)超濾濃縮后的纖維素酶液，經(jīng)計(jì)算，該過程的纖維素酶純化倍數(shù)為3.15，酶活收率為97.60%。

2.3 纖維素酶液的凝膠色譜分離結(jié)果

將經(jīng)過二級(jí)鹽析和二級(jí)超濾提取的纖維素酶分別進(jìn)行G-75凝膠色譜層析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 二級(jí)鹽析（A）和二級(jí)超濾（B）后纖維素酶液G-75凝膠色譜圖譜Fig.4 Gel chromatogram of cellulase solution G-75 after secondary salting-out(A)and secondary ultrafiltration(B)

由圖4可知，經(jīng)二級(jí)鹽析和二級(jí)超濾提取獲得的纖維素酶分別經(jīng)過G-75凝膠色譜層析，均獲得5個(gè)洗脫峰，經(jīng)測(cè)定，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)洗脫峰具有纖維素酶活性，這是由于纖維素酶是一種復(fù)合酶系，由葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶和β-葡糖糖苷酶組成，且三種酶所帶電荷和分子質(zhì)量均不同[20-21]，因此在進(jìn)行凝膠色譜層析過程中，其不同組分的纖維素酶分布于不同的洗脫峰中。將圖4（A）中的1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)洗脫峰合并，冷凍干燥后測(cè)定其纖維素酶活性為13 675.76 U/g，計(jì)算其酶活收率為96.3%，純化倍數(shù)為7.34；將圖4（B）中的1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)洗脫峰合并，冷凍干燥后經(jīng)測(cè)定其纖維素酶活性為12 769.87U/g，經(jīng)計(jì)算，其酶活收率為95.2%，純化倍數(shù)為6.74。

2.4 分離提取纖維素酶兩種工藝對(duì)比

本研究建立了兩種分離提取纖維素酶的生產(chǎn)工藝，即二級(jí)鹽析-G-75凝膠色譜法（簡(jiǎn)稱鹽析-色譜法）和二級(jí)超濾-G-75凝膠色譜法（簡(jiǎn)稱超濾-色譜法），兩種工藝的對(duì)比結(jié)果如表1所示。

表1 兩種分離提取纖維素酶工藝對(duì)比Table 1 Comparison of two kinds of separation and extraction process of cellulase

由表1可知，兩種工藝的總酶活收率均＞90%，而且超濾色譜法略高于鹽析色譜法；鹽析色譜法的總純化倍數(shù)為31.41，超濾色譜法為21.23，說明鹽析-色譜法較超濾-色譜法能獲得更高純度的纖維素酶，經(jīng)過鹽析-色譜法提取后，纖維素酶活性為13675.76U/g，高于超濾-色譜法（12769.87U/g）。但從實(shí)際生產(chǎn)過程及規(guī)模來看，鹽析過程由于要加入大量無機(jī)鹽，會(huì)對(duì)后續(xù)環(huán)保處理帶來較大壓力，而且鹽析過程不適合連續(xù)操作，而膜分離過程適合連續(xù)操作，并且處理規(guī)模大，不需要添加其他物質(zhì)。因此，在小規(guī)模間歇過程分離提取纖維素酶時(shí)，可以選擇鹽析-色譜法；在連續(xù)、大規(guī)模分離提取纖維素酶時(shí)，可以選擇膜分離-色譜法。

3 結(jié)論

本研究建立了兩種分離提取纖維素酶的方法，分別為二級(jí)鹽析-G-75凝膠色譜法和二級(jí)超濾-G-75凝膠色譜法。通過（NH4）2SO4飽和度對(duì)纖維素酶沉淀效果的研究以及鹽析后凝膠色譜分析，確立了二級(jí)鹽析-G-75凝膠色譜法分離提取纖維素酶的工藝為：纖維素酶發(fā)酵液經(jīng)0.22μm微濾膜預(yù)處理后，先采用20%飽和度的（NH4）2SO4沉淀部分雜蛋白，再用80%飽和度的（NH4）2SO4使上清液中的纖維素酶沉淀，最后經(jīng)G-75凝膠色譜層析，冷凍干燥后得固體纖維素酶粉末，纖維素酶活性為13 675.76 U/g，總酶活收率為91.96%，總純化倍數(shù)為31.41；通過考察纖維素酶系分子質(zhì)量大小以及膜通量與操作壓力之間的線性關(guān)系，并最終通過凝膠色譜分析，確立了二級(jí)超濾-G-75凝膠色譜法分離提取纖維素酶的工藝為：纖維素酶發(fā)酵液經(jīng)0.22μm微濾膜預(yù)處理后，以30.165 mL/（min·m2）的膜通量分別流過膜孔徑為6×104Da和1×104Da的超濾膜，此過程為連續(xù)過程，兩個(gè)膜的操作壓力分別為0.050 MPa和0.037 MPa，再將其經(jīng)過G-75凝膠色譜層析，經(jīng)冷凍干燥后得固體纖維素酶粉末，纖維素酶活性為12 769.87U/g，總酶活收率為92.91%，總純化倍數(shù)為21.23。

研究表明，兩種工藝均適合工業(yè)化分離提取纖維素酶，各具特點(diǎn)。二級(jí)鹽析-G-75凝膠色譜法適合小規(guī)模間歇操作，其獲得的纖維素酶純度高；二級(jí)超濾-G-75凝膠色譜法適合大規(guī)模連續(xù)操作，不需要添加其他物質(zhì)，對(duì)環(huán)境無污染。

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