盧 振，孟 鎮(zhèn)，鐘其頂*，張世偉，呂志遠(yuǎn)，肖冬光

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；3.濟(jì)南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司，山東 濟(jì)南 250115）

我國白酒歷史悠久，多種微生物混合發(fā)酵及獨(dú)特的生產(chǎn)工藝形成了白酒不同的風(fēng)格與香型，其中濃香型白酒以窖香濃郁，綿甜醇厚等特點(diǎn)贏得了消費(fèi)者的青睞，在白酒行業(yè)中占據(jù)主導(dǎo)地位。在濃香型白酒釀造過程中，新窖泥、窖底泥和窖壁泥因水分活度、靜壓強(qiáng)度、厭氧環(huán)境[1-2]等原因逐漸形成了窖泥微生物生長繁殖的微生態(tài)系統(tǒng)。窖池泥對白酒呈香呈味起著至關(guān)重要的作用，然而窖泥板結(jié)、結(jié)晶、鈣化等現(xiàn)象[3-5]有一定的延滯性，工廠無法及時發(fā)現(xiàn)窖泥質(zhì)量退化進(jìn)而影響原酒品質(zhì)。岳媛媛等[6-7]分析了正常窖泥的優(yōu)勢微生物，但僅限于可培養(yǎng)微生物，加之培養(yǎng)要求高、耗時長等原因而無法作為工廠檢測窖泥質(zhì)量的有效指標(biāo)?，F(xiàn)代分子生物學(xué)方法克服了可培養(yǎng)方法的弊端，如黃瑩娜等[8]基于高通量測序技術(shù)比較了兩種不同窖齡窖泥的主要細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)；袁玉菊等[9]利用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）方法分析了新窖泥、老窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，極大豐富了對窖泥中微生物的認(rèn)識，但多數(shù)報(bào)道是從研究角度分析不同窖齡、不同性狀、不同地區(qū)窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)差異的，而工廠應(yīng)用方面的案例相對較少，在實(shí)際應(yīng)用中工廠要綜合時間、成本和可靠性選擇一種技術(shù)手段來判定窖泥的性質(zhì)，以保證釀造車間窖泥的正常使用。

本研究以新窖泥、窖壁泥和窖底泥作為研究對象，應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對窖泥進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，以期找到指示不同類型窖泥的微生物指紋圖譜或條帶，以期為工廠深入探究窖泥質(zhì)量評價方法和人工養(yǎng)護(hù)提供參考，進(jìn)而正確指導(dǎo)工廠穩(wěn)定釀造白酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品取自山東某酒廠濃香型白酒釀造車間的窖壁泥、窖底泥以及培育好待入池的新窖泥，新窖泥X、P取自不同的酵房。窖泥樣品如表1所示。

表1 窖泥樣品編號Table 1 Number of pit mud samples

窖底泥和新窖泥采用“五點(diǎn)取樣法”，即取四周的四個點(diǎn)與中心一點(diǎn)混合均勻。窖壁泥則從距窖池頂部50 cm的窖壁四周取樣，混合均勻后置于-20℃冰箱備用，每組窖泥取2個平行樣品提取基因組DNA。

四甲基乙二胺、過硫酸銨、尿素（均為分析純），溶菌酶、蛋白酶K（均為生化試劑）：生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA Marker、Gel Stain染料、Trans Taq HIFIDNA Polymerase、pEASY-T1 Cloning Kit試劑盒：北京全式金生物技術(shù)有限公司；所有引物合成及測序由生工生物（上海）股份有限公司完成。

LB（Luria Bertani）液體培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，去離子水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.5，121℃滅菌20 min后加入氨芐青霉素，使其終濃度為10μg/mL；LB固體培養(yǎng)基再加入20 g瓊脂粉；北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T100型PCR擴(kuò)增儀、DYCP-31E型瓊脂糖電泳儀：北京六一儀器廠；DCodeTM System變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 窖泥基因組提取及PCR擴(kuò)增

在無菌條件下，稱取0.3 g樣品于2 mL的離心管中，加1 mL脫色液，漩渦振蕩3～5 min后，37℃水浴15 min，10 000 r/min離心10 min，棄上清，重復(fù)上述步驟3～4次，直至上清液較淺。參考孟鎮(zhèn)等[10]的方法，提取窖泥總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于-20℃保存。

以提取的窖泥基因組DNA為模板，利用F338GC/R518通用引物擴(kuò)增16SrRNA V3區(qū)，目的片段長度約230 bp[11]。擴(kuò)增體系為：DNA模板1μL，10×PCR Buffer緩沖液5 μL，dNTP 4μL，正反向引物各1μL，Taq酶0.5μL，ddH2O補(bǔ)平至50μL。為減少非特異性擴(kuò)增，采用降落PCR擴(kuò)增程序即：95℃預(yù)變性5min；94℃變性5min，65～55℃50s（每個循環(huán)后退火溫度下降0.5℃），72℃、3min，20個循環(huán)；94℃、1min，55℃、50 s，72℃、3 min，10個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后置于-20℃糖凝保存，以備后續(xù)DGGE檢測。

1.3.2 變性梯度凝膠電泳

制備濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度梯度為40%～60%（100%變性劑為7 mol/L尿素，40%去離子甲酰胺），PCR產(chǎn)物上樣量為45μL。待1×TAE緩沖液加熱至60℃后，先在20V電壓條件下電泳30min再調(diào)至120 V，電泳6 h。電泳結(jié)束后的凝膠置于Gelstain染液中染色60 min，清水脫色20 min后置于成像系統(tǒng)中觀察，拍照。

1.3.3 DGGE圖譜分析

利用Quantity one4.6.2軟件根據(jù)圖譜中條帶光密度值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。本研究主要使用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H），Simpson辛普森指數(shù)（D），Pielou均勻度指數(shù)（E）來反映群落個體分布的均勻性、種群之間的多樣性變化[12]。利用UPGMA算法[13]對不同窖泥樣品進(jìn)行聚類，分析窖泥樣品間的相似性系數(shù)（CS）。

1.3.4 DGGE條帶的回收、克隆、測序

從凝膠上切取目的條帶，加入超純水4℃過夜，取1μL上清液，以不帶GC夾子的通用引物再次擴(kuò)增DNA片段，擴(kuò)增體系及程序同1.3.1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，采用pEASY-T1 Cloning Kit試劑盒將目的片段與載體連接，連接產(chǎn)物與大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞融合后在37℃、180 r/min培養(yǎng)10h，然后轉(zhuǎn)接至LB固體平板上，從平板上挑取陽性克隆子至2mLLB液體培養(yǎng)基中，菌液送生工測序公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥16SrRNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖1 16S rRNA片段擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA fragment amplification

由圖1可知，不含樣品DNA模板的空白對照干凈無條帶，12個樣品的16SrRNA V3區(qū)目的片段長度在230 bp左右，與理論結(jié)果一致，并且獲得的擴(kuò)增片段亮度高，清晰無雜帶，可滿足后續(xù)的DGGE分析。

2.2 DGGE指紋圖譜的豐度及優(yōu)勢度比較

圖2 窖泥細(xì)菌的16S rRNA V3區(qū)PCR-DGGE指紋圖譜Fig.2 PCR-DGGE fingerprints of 16S rRNA V3 region from bacterial community in pit mud

由圖2可知，不同性狀的窖泥樣品經(jīng)過電泳均可分離出多條電泳條帶。圖中2～12號是正常窖壁泥、窖底泥和新窖泥中的共有條帶。除了共有條帶外，1號和18號為正常窖壁泥中的特有條帶；13號條帶僅存在于窖底泥中；14號、15號、16號和17號是新窖泥（X、P）的特有條帶；退化窖壁泥（B）僅有1號、2號和6號三條明顯條帶；退化窖底泥（F）除10號條帶比正常窖底泥（E）亮度高外，其他優(yōu)勢條帶的亮度相對較暗。

圖3 PCR-DGGE圖譜細(xì)菌群落豐度示意圖Fig.3 Schematic diagram of bacterial community abundance by PCR-DGGE fingerprints

由圖3可知，與正常窖壁泥泳道條帶相似程度由高到低依次是正常窖底泥、退化窖底泥、新窖泥和退化窖壁泥；不同類型窖泥的豐度為5～24，其中新窖泥最高，4個新窖泥樣品的平均豐度值為21，窖底泥和窖壁泥次之，平均豐度值為18.5，退化窖壁泥最低，最低豐度值僅為5。DGGE指紋圖譜中，18個條帶的優(yōu)勢度都＞5%，可以作為窖泥中生物量較高的微生物，即優(yōu)勢菌。

2.3 窖泥細(xì)菌DGGE指紋圖譜多樣性指數(shù)以及相似性比較

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)，Simpson辛普森指數(shù)（D），Pielou均勻度指數(shù)（E）是用來表征微生物群落多樣性的重要參數(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于評價土壤、污水等環(huán)境質(zhì)量[14]。對窖泥樣品微生物多樣性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。由表2可知，新窖泥Shannon-Wiener多樣性指數(shù)在2.47左右，辛普森指數(shù)和均勻度指數(shù)均高于窖壁泥和窖底泥，微生物種類最豐富，個體分布最均勻；2組窖壁泥之間、2組窖底泥之間的多樣性指數(shù)差異明顯。通常認(rèn)為相似指數(shù)高于0.60的群體具有較好的相似性[15]，本研究基于DGGE指紋圖譜的條帶光密度值對12個樣品進(jìn)行聚類，聚類結(jié)果如圖4。由圖4可知，4個新窖泥（X1、X2、P1、P2）單獨(dú)聚為一類，相似度高于0.66；窖底泥（E1、E2、F1、F2）聚為一類，相似度達(dá)到0.67；窖壁泥（A1、A2）與窖壁泥（B1、B2）分別聚類，相似度為0.61與0.68。由此可以看出，不同類型窖泥的細(xì)菌指紋圖譜差異明顯，杜禮泉等[16]研究發(fā)現(xiàn)豐谷酒業(yè)白酒窖泥質(zhì)量與細(xì)菌的相似性指數(shù)呈正相關(guān)，圖中也發(fā)現(xiàn)窖底泥退化前后的相似值為0.67，窖壁泥退化前后的相似值＜0.45，由此驗(yàn)證了優(yōu)勢微生物數(shù)量變少、群落結(jié)構(gòu)多樣性降低是窖泥退化引起質(zhì)量差異的主要原因，因此可利用PCR-DGGE細(xì)菌指紋圖譜方法對退化窖泥進(jìn)行快速、高效判定，及時更換新窖泥，以保證白酒的正常釀造。

表2 窖泥細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indexes of bacterial community in pit mud

圖4 不同窖泥細(xì)菌群落相似性指數(shù)樹狀圖Fig.4 Similarity dendrogram of bacterial community of different pit mud

2.4 窖泥細(xì)菌DGGE圖譜優(yōu)勢菌的測序分析

從濃香型窖壁泥、窖底泥和新窖泥中選取18個標(biāo)記的亮度高、分離清晰的條帶（見圖2），經(jīng)過切膠回收、純化連接、克隆轉(zhuǎn)化、測序后，將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，測序結(jié)果見表3。由表3可知，在所測的18個條帶中得到的最相似序列主要有互營單胞菌屬（Syntrophomonas）、梭狀芽胞桿菌（Clostridium）、組織菌屬（Tissierella）、Alkaliflexus、乙酸氧化菌屬（Syntrophaceticus）、熱厭氧桿菌屬（Thermacetogenium）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、里氏桿菌屬（Riemerella）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和Tumebacillus等。由此說明使用基于免培養(yǎng)方法的分子生物學(xué)技術(shù)可直接對窖泥樣品總DNA分析，豐富白酒發(fā)酵微生物的菌種資源，為更好地揭示白酒發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)及探究窖泥質(zhì)量提供強(qiáng)有力的技術(shù)手段。

表3 DGGE優(yōu)勢條帶的細(xì)菌16S rRNA基因測序結(jié)果Table 3 16S rRNA bacterial gene sequencing results of predominant bands by DGGE

2.5 窖泥DGGE圖譜優(yōu)勢條帶系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

圖5 窖泥中細(xì)菌16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA of bacteria obtained from pit mud

不同類型窖泥中優(yōu)勢微生物共14個屬（種），由圖5可知，各菌侏分別屬于4個門：擬桿菌門（ClusterⅠ）、放線菌門（ClusterⅡ）、厚壁菌門（ClusterⅢ）、變形菌門（ClusterⅣ）。窖壁泥、窖底泥和新窖泥中共有的優(yōu)勢微生物屬于厚壁菌門類（Firmicutes）和擬桿菌門類（Bacteroides），包括四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas），該屬菌能將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化成氫氣、乙酸，與其共生的產(chǎn)甲烷菌能利用氫氣改變分壓以促進(jìn)己酸合成[17]，此菌屬在該廠窖泥中含量豐富，而且在四川濃香型窖池窖泥中也有報(bào)道[18]；梭菌（Clostridiales），能代謝產(chǎn)生乙酸、丁酸、乙醇、丁醇等產(chǎn)物[19]，與濃香型白酒中香氣成分相關(guān)；泰氏菌（Tissierella）能夠?qū)⒓∷狒?、多肽、氨基酸等轉(zhuǎn)化為乙酸、丁酸和異戊酸等成分；互營乙酸氧化菌（Syntrophaceticus schinkii）和熱厭氧桿菌（Thermacetogenium）嚴(yán)格厭氧，以乙醇、糖類化合物、氨基酸為底物，能將乙酸轉(zhuǎn)化為甲烷[20-21]；瘤胃菌（Ruminococcaceae）能夠降解纖維素。新窖泥中微生物最豐富，涵蓋了上述4個門類，其特有優(yōu)勢微生物為嗜熱雙歧桿菌（Bifidobacteriumthermophilum）、托木爾假單胞菌（Pseudomonastuomuerensis）、Riemerell屬和Enterobacterale科。Alkaliflexus屬為退化窖壁泥中的優(yōu)勢菌屬，該屬能夠代謝糖類、醇類和丙酮酸合成乙酸。Tumebacillus屬微生物只存在于窖壁泥中。紫單孢菌科（Porphyromonadaceae），僅存在與窖底泥中，該微生物能夠分解葡萄糖產(chǎn)生CO2，進(jìn)而調(diào)節(jié)窖泥的pH，促進(jìn)窖泥的成熟。

3 結(jié)論

利用PCR-DGGE技術(shù)對不同性狀濃香型白酒窖泥進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析。從DGGE指紋圖譜中可以看出，新窖泥、窖壁泥和窖底泥有11個共同條帶，新窖泥的豐度和多樣性最高，窖底泥次之，窖壁泥最低。根據(jù)窖泥的類型進(jìn)行細(xì)菌群落間的相似度分析，發(fā)現(xiàn)新窖泥能夠單獨(dú)聚為一簇，窖底泥聚為一簇；2組窖壁泥間相似性差異明顯。

對不同類型窖泥的優(yōu)勢微生物進(jìn)行測序后發(fā)現(xiàn)，窖泥中優(yōu)勢微生物包含擬桿菌門（Bacteroides）、放線菌門（Actinomyces）、變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）4個門類，其中新窖泥中微生物最豐富，涵蓋上述門類，假單胞菌Pseudomonas屬、Enterobacterale科，Riemerella屬和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）為新窖泥特有的優(yōu)勢微生物。窖池泥中主要是擬桿菌門（Bacteroides）和厚壁菌門（Firmicutes）2類。從窖池窖泥中檢測到的互營單胞菌屬（Syntrophomonas）、丙酮丁醇梭桿菌（C.acetobutylicum）、互營乙酸氧化菌（S.schinkii），都與濃香型白酒香氣成分形成有關(guān)，此外互營單胞菌屬（Syntrophomonas）在該廠窖泥中含量豐富，為多條優(yōu)勢條帶的最高相似菌屬。Alkaliflexus屬在退化窖壁泥中含量高，Tumebacillus屬微生物只存在于窖壁泥中。

因此工廠可以利用PCR-DGGE方法開展窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)分析，總結(jié)DGGE圖譜規(guī)律，及時發(fā)現(xiàn)退化窖泥。研究中發(fā)現(xiàn)退化窖泥中優(yōu)勢微生物種類減少，與正常窖泥的DGGE指紋圖譜可明顯區(qū)分，為了驗(yàn)證其差異，將繼續(xù)探究窖泥的真菌、古菌群落結(jié)構(gòu)，同時會采用熒光定量手段對各類窖泥的優(yōu)勢菌、特征菌進(jìn)行定量檢測，通過定性定量信息建立不同類型、不同質(zhì)量等級窖泥的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，并跟蹤窖泥的感官評分、理化指標(biāo)以及原酒成分，探究退化窖泥的理化特征，出具窖泥綜合質(zhì)量信息報(bào)告，為工廠預(yù)防窖泥退化提供數(shù)據(jù)參考。

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