郭 睿，楊 玲*，郭旭凱，段 冰，邵 強，柳青山，王花云

（山西省農(nóng)業(yè)科學院 高粱研究所，山西 晉中 030600）

黃酒又稱米酒，是我國的民族特產(chǎn)。黃酒酒精度低，耗糧少，集美味、營養(yǎng)和保健于一體。它富含多種氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素和對人體有益的礦物元素，并具有烹飪、藥用等功效[1]，符合世界低度飲料酒發(fā)展的趨勢，因而被國家列為重點扶植和發(fā)展的飲料酒之一[2]。優(yōu)質(zhì)原料是釀造高品質(zhì)酒的基本條件。黃酒以稻米、黍米、玉米、小米等為主要原料[3]，南方黃酒主要選用糯米為原料，北方黃酒主要以黍米為原料，以高粱為主要原料釀造黃酒近年來鮮有報道。

釀造專用高粱中單寧含量達到1.0%～1.5%，發(fā)酵過程中單寧能被轉(zhuǎn)化為分子質(zhì)量小的多酚類物質(zhì)。以高粱為原料經(jīng)過酶、曲等發(fā)酵過程，原料和輔料中的黃酮和多酚類物質(zhì)很容易溶于發(fā)酵液中[4]，且在發(fā)酵過程中，各種物質(zhì)發(fā)生復雜的化學與生化反應(yīng)，生成種類更多的酚類[5]。研究表明，黃酒酚類物質(zhì)的含量與黃酒的抗氧化能力呈正相關(guān)關(guān)系[6]，多酚含量越多，黃酒的抗氧化活性越強。高粱籽粒中含有一定量的黃酮類化合物[7]，黃酮類物質(zhì)具有清除體內(nèi)自由基、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)細胞周期、調(diào)節(jié)免疫力、抗菌、消炎多種生理功能[8]。多酚類物質(zhì)具有抗病毒、抑菌、抗癌、抗輻射、抗動脈硬化、預防心腦血管疾病和中風等多種生理功能[9]，且有延長產(chǎn)品保質(zhì)期的作用，在食品、醫(yī)藥以及保健品等方面具有廣泛的應(yīng)用價值[10]。

支鏈淀粉含量高的糯高粱易于糊化[11]，非常適合于釀酒有益微生物的生長繁殖和香味物質(zhì)代謝。另外，在加工黃酒的過程中，糯性高粱吸水率較快、飽和吸水量較低，糊化溫度低，具有省水節(jié)能的優(yōu)勢；且糯高粱價格要低于黍米、糯米等常用的黃酒釀造原料，采用糯高粱為原料釀制黃酒能夠大幅降低原料成本，增加企業(yè)利潤。因此，本研究提出以糯高粱為原料，釀酒大曲為糖化劑進行糖化發(fā)酵，在參考近年學者[12-14]采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝過程的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken響應(yīng)面法[15]對糯高粱糖化工藝進行優(yōu)化，得到最佳工藝條件，使釀出的糯高粱黃酒富含大量氨基酸、糖和風味物質(zhì)，使酒體更加有營養(yǎng)，創(chuàng)制一種新型的保健酒，并為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

晉糯3號糯高粱：產(chǎn)于山西省農(nóng)科院高粱研究所試驗田；大曲：購自山西汾陽某制曲廠（以大麥、豌豆為原料，大麥∶豌豆=6∶4）；黍米、藜麥：市售。

福林酚：北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度＞97%）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；乙醇、乙酸鉀、三氯化鋁、碳酸鈉、鹽酸、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、氫氧化鈉等均為市售分析純；沒食子酸（分析純）、蘆?。兌葹?5%）：美國西格瑪-奧德里奇公司；分析試驗用水為18.2MΩ超純水，釀造用水為市政自來水。

1.2 儀器與設(shè)備

EBC-LF麥芽標準粉碎機：麥科儀科技有限公司；AL204電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團；UV-3300紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖化工藝

首先將糯高粱清洗，去除雜質(zhì)與浮土，晾干后用粉碎機粉碎，過18目篩備用。稱取200 g篩上物加入120 mL沸水攪拌均勻加蓋潤糧12h。蒸鍋水開后將糯高粱上鍋蒸120min，期間曬水攪拌一次，保證將糯高粱蒸熟蒸透，攤涼后拌曲加水進行糖化，糖化結(jié)束后，測定糖化液中還原糖含量。

1.3.2 單因素試驗

選擇糖化過程的關(guān)鍵控制因素——加曲量、糖化時間、糖化溫度3個單因素，通過單因素試驗探討其對糯高粱糖化過程中還原糖含量的影響。

（1）加曲量的影響

準確稱取200g粉碎好的糯高粱，加沸水120 mL于室溫潤糧12 h后上蒸鍋蒸熟，攤涼至室溫后置于1 L燒杯中，拌入質(zhì)量為糯高粱干質(zhì)量5%、10%、15%、20%、25%的大曲，并加入煮沸殺菌的涼白開水使糧水比為1∶2（g∶mL），于55 ℃糖化24 h。

（2）糖化時間的影響

準確稱取200 g粉碎好的糯高粱，加沸水120 mL于室溫潤糧12 h后上蒸鍋蒸熟，攤涼至室溫后置于1 L燒杯中，稱質(zhì)量，拌入質(zhì)量為糯高粱干質(zhì)量15%的大曲，并加入煮沸殺菌的涼白開水使糧水比為1∶2（g∶mL），于55 ℃分別糖化3 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h。

（3）糖化溫度的影響

準確稱取200g粉碎好的糯高粱，加沸水120mL于室溫潤糧12 h后上蒸鍋蒸熟，攤涼至室溫后置于1 L燒杯中，稱質(zhì)量，拌入質(zhì)量為糯高粱干質(zhì)量15%的大曲，并加入煮沸殺菌的涼白開水使糧水比為1∶2（g∶mL），分別于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃糖化24 h。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化糖化工藝參數(shù)，得出最佳糖化條件。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 糖化工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for saccharification process optimization

1.3.4 分析測試

（1）還原糖含量測定

將糖化液攪勻后取醪液5 mL置于10 mL離心管于4 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾得澄清醪液。醪液還原糖含量的測定采用斐林試劑法[16]。

（2）總多酚含量的測定

采用福林酚法[17]測定黃酒中的總多酚含量，根據(jù)實際情況略有改動。將樣品稀釋20倍，吸取200μL置于5mL容量瓶中，加入1 mol/L福林酚試劑0.75 mL混勻，加入質(zhì)量分數(shù)20%的Na2CO3溶液1mL混勻，蒸餾水定容至5mL。30℃避光水浴90min，冷卻至室溫后于波長765nm處測定吸光度值。以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，總酚含量以沒食子酸計。

（3）總黃酮含量的測定

總黃酮含量的測定采用乙酸鉀/氯化鋁[18]法，根據(jù)實際情況略有改動。準確吸取200μL樣品置于5 mL容量瓶中，加入0.75 mL三氯化鋁（0.1 mol/L）和1 mL乙酸鉀溶液（1 mol/L），蒸餾水定容至5 mL，充分搖勻后室溫避光反應(yīng)30 min，4 000 r/min離心10 min。取上清液于波長420 nm處檢測其吸光度值。以蘆丁為標準品繪制標準曲線，總黃酮含量以蘆丁計。

（4）體外抗氧化活性試驗

抗氧化活性分析選用DPPH法[19]。準確稱取10mg DPPH，用體積分數(shù)為95%的乙醇溶液超聲輔助溶解，定容至100 mL，置于-20℃冰箱中保存，隨用隨取。精密吸取20 mL母液，用體積分數(shù)為95%乙醇定容至100 mL，此工作液的濃度即為50μmol/L[20-21]。精密吸取20μL、40μL、60μL、80μL、100μL黃酒液，蒸餾水補齊至200μL，加入3 mL工作液，避光室溫反應(yīng)90 min，4 000 r/min離心10 min后于波長517 nm處比色[22]，測定的吸光度值記作As。以體積分數(shù)為95%乙醇代替DPPH工作液，所測得吸光度值記作Ar。吸取200μL蒸餾水，加入3 mL工作液，避光室溫反應(yīng)90 min，于波長510 nm處比色，測定的吸光度值記作A0，DPPH自由基清除率按下式計算：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 加曲量對糯高粱黃酒糖化過程還原糖含量的影響

本試驗糖化劑為大曲，不同加曲量對還原糖含量的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著加曲量的增加，糯高粱黃酒糖化過程的還原糖含量先急劇增加，后趨于平緩，當加曲量為15%時，糖化液的還原糖含量達到最大值，繼續(xù)提高加曲量還原糖的含量沒有顯著升高。因此，最佳加曲量為糯高粱干質(zhì)量的15%。

圖1 加曲量對還原糖含量的影響Fig.1 Effect of Daqu inoculum on reducing sugar contents

2.1.2 糖化時間對糯高粱糖化過程還原糖含量的影響

圖2 糖化時間對還原糖含量的影響Fig.2 Effect of saccharification time on reducing sugar contents

糖化時間對還原糖含量的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，在糖化過程中，隨著時間的推移，大曲中的各種酶類被激活，糊化醪中的淀粉、蛋白質(zhì)、半纖維素等不溶性高分子物質(zhì)被大曲中的復合酶系水解成糖類、糊精、氨基酸等可溶性的低分子物質(zhì)，糖度逐漸增加，當達到24 h后，糊化醪中的還原糖含量隨著糖化時間的延長不再顯著增加，出于經(jīng)濟的角度，糖化時間30 h為宜。

2.1.3 糖化溫度對糯高粱糖化過程還原糖含量的影響

糖化溫度對還原糖含量的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著糖化溫度的升高，糯高粱黃酒釀制過程中還原糖含量呈先增加后減少的趨勢，在糖化溫度為55℃時還原糖含量最大。這是因為糖化溫度較低時，不能充分激活糖化酶的活力，影響熟化淀粉的糖化效果；糖化溫度偏高使得各種淀粉酶失活，淀粉不能被糖化[23]。因此，最佳糖化溫度為55℃。

圖3 糖化溫度對還原糖含量的影響Fig.3 Effect of saccharification temperature on reducing sugar contents

2.2 響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)處理及模型擬合

采用Design Export 10.0.3軟件對前期響應(yīng)面試驗設(shè)計所做得的糯高粱糖化數(shù)據(jù)進行處理，試驗結(jié)果見表2，表2中1、7、8、11、17號試驗為中心零點試驗，重復5次，以估計試驗誤差，其他試驗為析因試驗。根據(jù)試驗相應(yīng)值進行因變量與自變量的多元線性回歸和二項式方程擬合，得到還原糖含量Y預測值對自變量的二次多項式回歸方程：Y=17.08+0.27A+0.44B+0.55C-0.14AB-0.13AC+0.14BC-0.33A2-0.96B2-0.49C2。由表3可知，回歸方程模型的P值為0.000 4＜0.01，表明該試驗模型顯著；失擬項P值為0.257 4＞0.05，說明方程對試驗擬合程度良好，可以用此模型對糯高粱糖化工藝進行分析和預測。模型的決定系數(shù)R2=0.959 7，說明3因素對還原糖影響中95.97%的試驗數(shù)據(jù)變異可用此模型解釋。方程模型中加曲量、糖化溫度、糖化時間3個因素均對還原糖含量有顯著影響?；貧w方程的各項方差分析結(jié)果表明，糖化溫度是影響糯高粱糖化效果的最顯著因素，其次是糖化時間，加曲量在10%～20%范圍內(nèi)時對糖化工藝的影響最不顯著。

表2 糖化工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for saccharification process optimization

加曲量、糖化時間、糖化溫度、各因素交互作用對糖化工藝的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，在糖化過程中，選擇的參數(shù)范圍內(nèi)存在極值，相比較而言，糖化時間和糖化溫度對糖化工藝的影響最為顯著。由軟件分析得到還原糖的最大響應(yīng)值為17.32 g/100 mL，對應(yīng)的加曲量為16.19%，糖化時間為25.49 h，糖化溫度為55.27℃。

圖4 各因素交互作用對還原糖含量影響的響應(yīng)面與等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factor on reducing sugar contents

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化條件驗證試驗

根據(jù)實際情況，選取工藝參數(shù)為加曲量16.2%，糖化時間25.5 h，糖化溫度55.3℃。由表4可知，在此優(yōu)化條件下，設(shè)3個重復，糖化后還原糖平均含量為17.29 g/100 mL，與理論值的相對誤差為0.19%，驗證試驗表明，響應(yīng)面法對糯高粱糖化工藝的優(yōu)化是可行的，得到的糖化工藝條件具有實際應(yīng)用價值。

表4 糖化工藝驗證試驗結(jié)果Table 4 Validation experiments results of saccharification process

2.4 黃酒總多酚、總黃酮含量與抗氧化性分析

將糖化完成的醪液自然冷卻后加入糯高粱干質(zhì)量0.5%的釀酒酵母，攪拌均勻，為使釀成的黃酒達到甜型黃酒標準，向糖化完成的醪液中加入體積分數(shù)為醪液7.5%的糟燒白酒（酒精度為75%vol），封口，置于18℃的恒溫箱中后發(fā)酵45d，期間每隔一星期攪拌一次。將發(fā)酵完成后的醪液壓榨過濾，于78℃滅菌30 min，調(diào)整酒精度為14%vol，制成成品糯高粱黃酒。

本研究對以糯高粱、黍米、藜麥3種雜糧為主要原料，采用相同的輔料、工藝釀造而成的3種黃酒進行分析，對比其多酚含量與抗氧化活性。酒樣1為糯高粱黃酒，酒樣2為黍米黃酒，酒樣3為藜麥黃酒，均為實驗室自制，測樣前均調(diào)整酒精度為14%vol。

2.4.1 三種黃酒的品質(zhì)指標

三種成品黃酒均具有黃酒特有的香氣，口感香甜醇和，酒味濃郁，高粱黃酒色澤黃亮帶紅，清澈透明，黍米黃酒金黃發(fā)亮，清澈透明，藜麥黃酒帶紅亮透明，清澈透明。按照GB/T 13662—2008《黃酒》中給出的甜型黃酒測試方法對三種黃酒的相關(guān)指標測試，結(jié)果如表5所示，三種黃酒的相關(guān)理化指標均符合GB/T 13662—2008《黃酒》中傳統(tǒng)甜型黃酒的限值規(guī)定。

表5 三種黃酒的理化指標Table 5 Physical and chemical indexes of three kinds of Chinese cereal wine

2.4.2 三種黃酒總多酚含量

圖5 三種黃酒總多酚含量Fig.5 Total polyphenol contents in three types of Chinese cereal wine

以沒食子酸為標準品，準確移取沒食子酸質(zhì)量為0、2μg、4μg、6μg、8μg、10μg、12μg、16μg、20μg的標準品，按照實驗方法處理后于765 nm處測其吸光度值，以吸光度值（y）為縱坐標，以沒食子酸當量（x）為橫坐標繪制標準曲線，其回歸方程為y=0.037 1x+0.009 9，R2=0.999 5。根據(jù)標準曲線回歸方程計算出三個黃酒樣品中總多酚含量（每個樣品3次重復）。

三個黃酒樣品中高粱黃酒的總多酚含量最高，為0.71 mg/mL，其次為藜麥黃酒0.69 mg/mL，黍米黃酒最低，為0.47 mg/mL。

2.4.3 三種黃酒總黃酮含量

以蘆丁為標準品，準確移取蘆丁當量為0.005mg、0.01mg、0.015 mg、0.02 mg、0.025 mg、0.03 mg、0.035 mg的蘆丁標準液按照實驗方法處理后于波長420 nm處測其吸光度值，以吸光度值（y）為縱坐標，以蘆丁當量（x）為橫坐標繪制標準曲線，其回歸方程為y=6.467 5x+0.004 7，R2=0.999 5。根據(jù)標準曲線回歸方程計算出三個黃酒樣品中總黃酮含量（每個樣品3次重復）。

三種黃酒中總黃酮含量差異明顯，藜麥黃酒中總黃酮含量最多，達到了7.39 mg/L，其次為高粱黃酒總黃酮含量1.12 mg/L，黍米黃酒總黃酮含量最低，為0.17 mg/L。

圖6 三種黃酒總黃酮含量Fig.6 Total flavonoid contents in three types of Chinese cereal wine

2.4.4 三種黃酒抗氧化活性分析

圖7 不同添加量的三種黃酒DPPH自由基清除率Fig.7 DPPH free radical scavenging rate of three kinds of Chinese cereal wine with different addition

根據(jù)實驗方法測定三種黃酒的DPPH體外自由基清除率，結(jié)果見圖7。由圖7可知，表明三種黃酒都有一定的DPPH自由基清除能力，表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。其中，高粱黃酒的抗氧化活性最強，當黃酒的加入量為80μL時已達反應(yīng)平衡，當黃酒加入量為100μL時，DPPH自由基清除率為94.61%。其次是藜麥黃酒，當黃酒加入量為100μL時，總DPPH自由基清除率為71.45%。黍米黃酒的DPPH自由基清除能力最弱，當黃酒加入量為100μL時，DPPH自由基清除率為41.89%。

三種黃酒都含有一定量的總多酚、總黃酮，均表現(xiàn)出了比較強的自由基清除能力。高粱黃酒的總多酚含量與藜麥黃酒相差不大，黍米黃酒總多酚含量不及高粱與藜麥黃酒。藜麥黃酒總黃酮含量最高，是高粱黃酒的6.6倍，黍米黃酒的43.5倍，在體外DPPH自由基清除率方面，高粱黃酒的自由基清除能力最強，這與闕斐等[6]的研究結(jié)論——多酚含量越高，抗氧化能力越強，基本一致，但黃酒中還含有維生素C、維生素E及其他抗氧化活性物質(zhì)，這也解釋了高粱黃酒與藜麥黃酒多酚含量相近，但高粱黃酒的抗氧化性顯著高于藜麥黃酒。黍米黃酒的總多酚、總黃酮含量都最低，其DPPH自由基清除能力也最弱。

3 結(jié)論

本研究通過單因素及響應(yīng)面試驗得到糯高粱釀造黃酒糖化工藝的最佳工藝條件為，加曲量為糯高粱干質(zhì)量的16.2%，糖化時間25.5 h，糖化溫度55.3℃，各因素對還原糖含量的影響次序依次為：糖化溫度＞糖化時間＞加曲量。采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)可靠，對實際糖化工藝有一定的指導意義。三種黃酒均含有總多酚、總黃酮，均具有一定的DPPH自由基清除活性，高粱黃酒總多酚含量最高，藜麥黃酒總黃酮含量最高。在抗氧化性方面，高粱黃酒的DPPH自由基清除率最高，比藜麥黃酒與黍米黃酒更具優(yōu)勢。

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