王一雯，馬 煥，權(quán)淑靜，劉德海*，解復(fù)紅，王佰濤，安明理

（河南省科學(xué)院 生物研究所，河南 鄭州 450008）

非還原性雙糖—海藻糖自1832年由WIGGERSH A L等從麥角菌中分離提取后，有關(guān)其化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化特性、功能應(yīng)用及生產(chǎn)研發(fā)等相關(guān)研究便層出不窮[1-6]。這種對稱的雙葡萄糖分子結(jié)構(gòu)擁有最小的自由能和化學(xué)鍵能，所具有的溫度穩(wěn)定性及pH適應(yīng)性遠(yuǎn)超麥芽糖、蔗糖、葡萄糖等其他糖類小分子，使其成為保持細(xì)胞活性、保濕類化妝品中的重要組成成分，更可作為防止食品劣化、保持食品新鮮風(fēng)味、提升食品品質(zhì)的獨(dú)特食品配料。由于海藻糖在食品、化妝品和制藥等行業(yè)的應(yīng)用前景巨大，全球市場對海藻糖的需求量逐年上升，海藻糖的生產(chǎn)也由千克級(jí)別向成噸規(guī)模不斷發(fā)展。其生產(chǎn)方法從微生物提取這種天然途徑到化學(xué)合成、酶轉(zhuǎn)換法、工程菌構(gòu)建等人工途徑，每一條有關(guān)海藻糖生成途徑的創(chuàng)新和改進(jìn)都是對相關(guān)生產(chǎn)工藝的全面改善與優(yōu)化[7-10]；從簡單檢測海藻糖二聚體構(gòu)型到借助X射線衍射技術(shù)，觀測與海藻糖合成或分解有關(guān)的6-磷酸海藻糖合成酶、6-磷酸海藻糖磷酸酶、麥芽寡糖基海藻糖合成酶等各種酶分子的晶體結(jié)構(gòu)[11-12]，每一種蛋白晶體的理化分析均有助于深入了解海藻糖合成與分解機(jī)制、改進(jìn)和完善海藻糖的工業(yè)生產(chǎn)途徑。

酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的海藻糖因其產(chǎn)量高、成本低而逐漸走入了人們的視線，目前已知的酶轉(zhuǎn)化法生成海藻糖主要分為三種途徑，兩種體系。一是以葡萄糖為底物的6-磷酸海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）與6-磷酸海藻糖磷酸酶（trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP）途徑（即TPS-TPP途徑，亦稱為OtsA/OtsB途徑），LELOIRLF等[13]在布魯士酵母中首次發(fā)現(xiàn)該途徑。該途徑由6-磷酸海藻糖合成酶催化尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖，合成6-磷酸海藻糖，再在6-磷酸海藻糖磷酸酯酶作用下脫離磷酸基團(tuán)最終生成海藻糖。該途徑在自然界中分布最為廣泛，在真核生物、真細(xì)菌和古生菌中都有發(fā)現(xiàn)，但反應(yīng)過程需要大量耗能，因而不被用于工業(yè)生產(chǎn)；二是麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶途徑（即TreY-TreZ途徑），由日本科研人員在節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）Q36中首次發(fā)現(xiàn)[14]，也包括兩步酶促反應(yīng)。由麥芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyl trehalosesynthase，MTS）催化麥芽糊精，經(jīng)分子間重排作用將α-1,4-糖苷鍵扭轉(zhuǎn)為α-1,1-糖苷鍵，形成麥芽寡糖基海藻糖，然后由麥芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyl trehalosetrehalohydrolase，MTH）水解麥芽寡糖基海藻糖，釋放一分子海藻糖。該途徑主要存在于細(xì)菌和古生菌中，反應(yīng)底物為廉價(jià)淀粉且反應(yīng)單向進(jìn)行，因而長期以來被廣泛運(yùn)用到規(guī)模化生產(chǎn)中，但該過程程序繁瑣、技術(shù)被國外壟斷導(dǎo)致生產(chǎn)成本一直居高不下。以上4種蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)現(xiàn)已被全面解析出來[15]，兩種途徑均以淀粉為底物，經(jīng)兩步酶解反應(yīng)最終產(chǎn)生海藻糖，稱為雙酶法[16]，與之相關(guān)的催化機(jī)理和優(yōu)化改造也在進(jìn)行全面深入的研究和探索。海藻糖合成酶途徑（trehalosesynthase，TreS途徑）的發(fā)現(xiàn)打破了TreY-TreZ途徑長期壟斷的局面，其利用麥芽糖為原料，經(jīng)分子內(nèi)重排產(chǎn)生海藻糖，稱為單酶法。該途徑反應(yīng)過程簡單可控且原料成本低廉，已被國內(nèi)外眾多專家視為未來海藻糖酶法生產(chǎn)新方向。但該過程發(fā)現(xiàn)較晚，有關(guān)海藻糖合酶的晶體結(jié)構(gòu)及催化作用機(jī)制一直未能被人們了解，因而延誤了利用該酶在海藻糖規(guī)模化生產(chǎn)中的應(yīng)用。

海藻糖合酶最早在脂肪桿菌（Pimelobacter sp.）R48中被證實(shí)發(fā)現(xiàn)[17]，隨后在棲熱水生菌（Thermus aquaticus）[18]、恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）[19]、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）[20]、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）[21]玫瑰鏈霉菌（Streptosporangium roseum）[22]和玫瑰微球菌（Micrococcus roseus）[23]等各種微生物中被相繼發(fā)現(xiàn)，而自嗜熱菌中分離得到的海藻糖合酶往往反應(yīng)溫度較高，如在水生棲熱菌中純化得到的海藻糖合酶，其在pH5.5～9.5均能保持穩(wěn)定并且在80℃條件下保溫60 min也不失活[24]，具有廣泛的應(yīng)用潛力，但有關(guān)海藻糖合酶蛋白的晶體學(xué)研究成果直到2013年以后才逐漸明朗。

1 海藻糖合酶的結(jié)構(gòu)

海藻糖合酶是一個(gè)α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，屬于糖苷水解酶第13家族成員（簡稱GH13家族），與蔗糖水解酶、淀粉蔗糖酶和蔗糖異構(gòu)酶等在結(jié)構(gòu)上具有很高的同源性[25-26]。目前所發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)海藻糖合酶都具有該家族蛋白質(zhì)所含有的4個(gè)保守區(qū)[27]。超速離心分析發(fā)現(xiàn)[28]，海藻糖合酶在液態(tài)和固態(tài)晶體中多以二聚體的形式存在；每個(gè)不對稱單元在空間群為P212121的斜方晶系中形成二聚體結(jié)構(gòu)，在空間群為P21的單斜晶系中形成海藻糖合酶四聚體；無論是二聚體結(jié)構(gòu)還是四聚體結(jié)構(gòu)，組成這些低聚物的每條單體結(jié)構(gòu)上幾乎完全相同，二者都具有熱力學(xué)穩(wěn)定性，相互之間存在著動(dòng)態(tài)平衡。

海藻糖合酶的單體結(jié)構(gòu)與GH13家族的大多數(shù)單體酶一樣主要有三大結(jié)構(gòu)域：A區(qū)、B區(qū)和C區(qū)（見圖1）。A區(qū)即N-端結(jié)構(gòu)域，是TreS的催化核心區(qū)域，由（β/α）8三磷酸異構(gòu)酶筒狀蛋白組成，即8個(gè)α-螺旋圍繞8個(gè)平行的β-片層所形成的結(jié)構(gòu)蛋白（以下簡稱（β/α）8核心蛋白），酶的活性中心就位于該區(qū)域，其內(nèi)部含有一個(gè)催化裂縫，由酸性三聯(lián)體Asp-Glu-Asp和各種保守的底物結(jié)合殘基構(gòu)成[29]。B區(qū)域嵌入了（β/α）8核心蛋白中的第三組β-折疊和α-螺旋，通過16個(gè)氫鍵和58個(gè)氨基酸殘基組成的疏水性區(qū)域與（β/α）8蛋白緊密互作，其共包含1個(gè)α-螺旋、三個(gè)反向平行的β-折疊和一個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，該離子結(jié)合位點(diǎn)可維持A區(qū)和B區(qū)交界面的穩(wěn)定[30]。C區(qū)由兩片反相平行的β-折疊組成，這兩個(gè)β-折疊片層分別包含該區(qū)的β1-β3、β5和β7共五條β折疊股以及β4和β6兩條β折疊股。該區(qū)域借助9個(gè)氫鍵和47個(gè)氨基酸殘基組成的疏水性區(qū)域與A區(qū)緊密相連。TreS的C區(qū)結(jié)構(gòu)與GH13家族成員的區(qū)域結(jié)構(gòu)差別較大，不同物種中的海藻糖合酶其C區(qū)序列也多種多樣，這可能是導(dǎo)致各成員間功能多樣性、差異化的主要原因[28]。TreS還有兩個(gè)特有的亞域區(qū)域，將二者分別命名為S7、S8。S7（氨基酸序列從315-361）亞域內(nèi)含有一個(gè)短片段的α-7'-螺旋，和B區(qū)一起作為門戶開關(guān)負(fù)責(zé)活性位點(diǎn)的打開和閉合；亞域S8（氨基酸序列從384-449）則沒有表現(xiàn)出規(guī)律性的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其與C區(qū)共同形成二聚體的交界面[28，31-32]。

圖1 海藻糖合酶二聚體(a)和單體(b)結(jié)構(gòu)帶狀示意圖[28]Fig.1 Banding schematic diagram of the trehalose synthase dimer(a)and monomer(b)structure

GH13家族成員的蛋白結(jié)構(gòu)中還會(huì)有金屬離子，它們負(fù)責(zé)維持蛋白結(jié)構(gòu)的完整性（見圖2）。TreS單體結(jié)構(gòu)中也有5個(gè)非常明確的離子結(jié)合位點(diǎn)。第一個(gè)是Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，位于結(jié)構(gòu)域A、B交界面活性位點(diǎn)1.3 nm處。該離子周圍結(jié)合了Asn132、Asp200、Tyr234、Leu235、Glu237和兩個(gè)水分子等共七個(gè)配位殘基。第二，一個(gè)六配位的Mg2+結(jié)合位點(diǎn)，位于A區(qū)內(nèi)的一個(gè)溶劑可及環(huán)當(dāng)中，與催化中心相距2.5nm，Asp51、Asn53、Asp55、Ile57、Asp59和一個(gè)水分子與Mg2+六配位相互結(jié)合，二者均為TreS蛋白結(jié)構(gòu)中必不可少的金屬離子[33]。

另外還監(jiān)測到4個(gè)氯離子結(jié)合位點(diǎn)（見圖2）。1號(hào)Cl-位于離催化中心0.8 nm的位置，與其配位的是活性位點(diǎn)上的Arg228、Glu343、Arg339和一個(gè)水分子。另外兩個(gè)Cl-分別位于延伸環(huán)L7和L1附近，分別距離活性中心1.3 nm、1.6 nm。L7中的2號(hào)Cl-與His341、Arg374、His341、Asn340、Arg375和一個(gè)水分子配位。3號(hào)Cl-位于L1中，與Arg47、Leu46和三個(gè)水分子相互配位。4號(hào)Cl-則偶爾出現(xiàn)于溶劑容易接觸的位置，可能是由于晶體封裝互作而形成[30]。

圖2 海藻糖合酶金屬離子結(jié)合位點(diǎn)[29]Fig.2 Metal ion binding site in the structure of trehalose synthase

活性位點(diǎn)是海藻糖合酶的核心結(jié)構(gòu)。由高度保守的酸性三聯(lián)體：Asp-Glu-Asp組成。這三個(gè)氨基酸殘基與（β/α）8蛋白的核心碳原子分別相距0.03 nm、0.113 nm和0.127 nm，首位的Asp用于親核反應(yīng)，Glu起到酸堿催化的作用，末位的Asp用來與底物結(jié)合。該活性位點(diǎn)位于一個(gè)狹長且封閉的空間內(nèi)，這種構(gòu)造可保證海藻糖合酶嚴(yán)格控制底物較多發(fā)生分子內(nèi)異構(gòu)化，盡可能減少水解反應(yīng)。

2 海藻糖合酶的催化作用機(jī)制

海藻糖合酶催化麥芽糖和海藻糖相互轉(zhuǎn)化的可逆反應(yīng)，麥芽糖和海藻糖都可以作為海藻糖合酶的底物。類似于麥芽寡糖基海藻糖合成酶，海藻糖合酶作為GH13家族中的一個(gè)轉(zhuǎn)葡糖苷酶也是一種分子異構(gòu)酶，借助230位的Asp攻擊-1亞位點(diǎn)處的底物異頭中心產(chǎn)生共價(jià)β-葡糖基酶中間體，使位于+1位割裂的葡萄糖分子在密閉的活性結(jié)構(gòu)內(nèi)旋轉(zhuǎn)并重新定位，重新攻擊共價(jià)中間體，與葡萄糖分子的1-OH或4-OH相連，以分子內(nèi)方式完成異構(gòu)化反應(yīng)。兩個(gè)芳香殘基Phe256和Phe280在酶活性位點(diǎn)的入口處形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，任意一個(gè)突變或者兩個(gè)同時(shí)突變會(huì)導(dǎo)致酶的水解作用極大增強(qiáng)[34]。以海藻糖生成反應(yīng)為例具體闡述海藻糖合酶的催化機(jī)制（見圖3）。首先，海藻糖合酶230位的Asp攻擊麥芽糖異頭中心發(fā)生糖基化，使麥芽糖中位于-1亞位點(diǎn)的葡萄糖分子與海藻糖合酶共價(jià)連結(jié)形成β-糖基酶中間體。此時(shí)，位于海藻糖合酶活性中心+1亞位點(diǎn)游離的葡萄糖分子在封閉的活性中心內(nèi)發(fā)生旋轉(zhuǎn)，隨酶構(gòu)象的改變而重新定位。隨后，旋轉(zhuǎn)后的葡萄糖分子再攻擊β-糖基酶復(fù)合物，使其去糖基化，海藻糖合酶與葡萄糖分子分離變回原始構(gòu)象，兩個(gè)葡萄糖分子再以α-1,1-糖苷鍵重新結(jié)合生成海藻糖。整個(gè)反應(yīng)體系的熱平衡常數(shù)為4.1∶1，由一對耦合的水解反應(yīng)維系平衡，海藻糖合酶依賴這種熱力學(xué)平衡能夠很容易地催化雙向反應(yīng)。雖然這種異構(gòu)化過程發(fā)生在密閉區(qū)域內(nèi)，但依然會(huì)伴隨10%的水解副反應(yīng)，而海藻糖合酶的構(gòu)象改變過程也成為該變構(gòu)反應(yīng)的限速步驟，這種構(gòu)象的改變與海藻糖合酶特有的亞域B和亞域S7結(jié)構(gòu)相關(guān)。類似的麥芽寡糖基海藻糖合酶（TreY）也要通過分子內(nèi)重排異構(gòu)化進(jìn)行催化反應(yīng)，只是反應(yīng)底物更多、過程更復(fù)雜且分子內(nèi)的重排范圍較小[29，35]。

圖3 海藻糖合酶催化機(jī)制[29]Fig.3 Catalytic mechanism of trehalose synthase

表1展示了海藻糖合酶在分別以麥芽糖和海藻糖為底物時(shí)發(fā)生催化反應(yīng)的部分動(dòng)力學(xué)參數(shù)。以麥芽糖為底物時(shí)，該酶促反應(yīng)的米氏常數(shù)Km=（8.0±0.9）mmol/L[32]，遠(yuǎn)小于以海藻糖為底物時(shí)的Km值，說明海藻糖合酶與麥芽糖的親和力高于海藻糖；但海藻糖合酶催化海藻糖的速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于麥芽糖，提示在工業(yè)生產(chǎn)過程中要盡早、及時(shí)地分離海藻糖與海藻糖合酶混合物；在以麥芽糖為底物發(fā)生酶促反應(yīng)時(shí)，整個(gè)過程的催化效率Kcat/Km是以海藻糖做底物發(fā)生反應(yīng)的3.2倍，說明海藻糖合酶催化麥芽糖的效率更高，反應(yīng)有利于向生成海藻糖的方向進(jìn)行。由此可見，雖然海藻糖合酶生產(chǎn)海藻糖的過程是一個(gè)可逆反應(yīng)，但海藻糖合酶在催化時(shí)具有偏向性，而且是偏向于催化麥芽糖、生成海藻糖的方向進(jìn)行反應(yīng)。因此，選擇海藻糖合酶大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)海藻糖具有一定的參考性和可行性。

表1 海藻糖合酶催化不同底物時(shí)的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)[32]Table 1 Enzyme kinetic parameters of trehalose synthase catalyzing different substrates

3 現(xiàn)狀與展望

海藻糖是一種可替代蔗糖并且口感較好的健康雙糖，適宜高血糖病人食用，但受限于其產(chǎn)量少、成本高，難以在消費(fèi)市場廣泛普及。目前利用海藻糖合酶TreS途徑開展的海藻糖大規(guī)模生產(chǎn)依然處于實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段。臺(tái)灣大葉大學(xué)通過制備生物反應(yīng)器設(shè)備率先實(shí)現(xiàn)利用人工合成的海藻糖合酶在5 L發(fā)酵罐中成功生產(chǎn)、分離純化出海藻糖，其轉(zhuǎn)化率達(dá)到（64.63±4.05）%，晶體純度為（92.6±0.02）%，回收率為94.2%，并且有效解決了海藻糖合酶催化過程中副產(chǎn)物葡萄糖、殘余麥芽糖的分離問題[36-37]，其轉(zhuǎn)變的高附加值產(chǎn)品葡糖酸和生物乙醇也進(jìn)一步增加了該途徑的市場競爭力，這是目前已發(fā)現(xiàn)的利用該酶研發(fā)生產(chǎn)海藻糖較為高效的技術(shù)設(shè)備和方法。而有關(guān)海藻糖合酶的水解副反應(yīng)和低轉(zhuǎn)化率等相關(guān)問題，有學(xué)者在司徒氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）CJ38中分離得到一種新型海藻糖合酶，該酶在催化麥芽糖與海藻糖相互轉(zhuǎn)化的過程中沒有副產(chǎn)物葡萄糖生成，這為利用海藻糖合酶生產(chǎn)海藻糖提供了一定基礎(chǔ)；更多學(xué)者則傾向于改造海藻糖合酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)，通過定點(diǎn)突變[38-39]、基因交換[40]等理性蛋白設(shè)計(jì)，易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[41]、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）改組[42]等非理性蛋白設(shè)計(jì)以及化學(xué)修飾[43]等改造大分子蛋白質(zhì)，以提高甚至創(chuàng)新酶的催化活性和物理性質(zhì)[44]，如WANG JH等[40]將嗜熱棲熱菌海藻糖合酶的C端與對耐輻射球菌（Deinococcusradiodurans）海藻糖合酶融合，構(gòu)建的新的雜合蛋白熱穩(wěn)定性比原耐輻射球菌海藻糖合酶有了明顯提高，而最適反應(yīng)溫度也由20℃提高至40℃；而WANGJH等[45]將海藻糖合酶與β-淀粉酶相互融合，構(gòu)建的融合蛋白能夠直接利用淀粉為底物生產(chǎn)海藻糖，比兩種酶分別作用的效率提高了2～3倍；CHOU H H等[46]通過定點(diǎn)突變技術(shù)將Asn530突變成為Pro，使得嗜苦古菌海藻糖合酶熱穩(wěn)定性略有上升，同時(shí)當(dāng)它以甜薯淀粉為底物時(shí)，在50℃反應(yīng)4 h后，海藻糖產(chǎn)量是野生型的1.3倍；王青艷等[47]通過定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)褐色高溫單孢菌海藻糖合酶等通過定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)褐色高溫單孢菌海藻糖合酶E352R突變子活力是野生型的1.25倍。也有通過構(gòu)建、篩選多種表達(dá)載體、改造大腸桿菌工程菌等方式以實(shí)現(xiàn)海藻糖的高效合成[30，48-49]，但這些研究目前還處于實(shí)驗(yàn)室研發(fā)起步階段，較難突破工業(yè)化生產(chǎn)采用的TreY-TreZ途徑。本文近年來綜述了海藻糖合酶的蛋白結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制的新成果和新進(jìn)展，有助于國內(nèi)相關(guān)從業(yè)者更新認(rèn)知、加快關(guān)于利用海藻糖合酶生產(chǎn)海藻糖的相關(guān)技術(shù)研發(fā)，早日實(shí)現(xiàn)利用海藻糖合酶規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)海藻糖。

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