張國權，羅崧方，黃建蓉，蔡曉燕，張延杰

（1.咀香園健康食品（中山）有限公司，廣東中山 528437；2.廣東藥科大學食品科學學院，廣東中山 528453）

桑葉是藥食兩用的重要資源，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎抑菌、抗腫瘤等多種生理活性和保健功能，黃酮類化合物是其中一種主要的活性成分[1-2]。紫外-可見分光光度法是植物中總黃酮含量測定的常用方法，在紫外區(qū)直接測定或經(jīng)顯色后在可見光區(qū)測定，顯色體系以亞硝酸鈉-硝酸鋁和三氯化鋁的研究和應用最為廣泛[3-10]。不同植物提取物中黃酮類化合物成分有差異，在采用分光光度法進行含量測定時，對影響檢測靈敏度和穩(wěn)定性等方面的因素進行系統(tǒng)研究，有利于優(yōu)化檢測條件，提高方法的適用性。試驗研究探討三氯化鋁比色法測定桑葉提取物總黃酮含量的影響因素，并對方法學進行考查，旨在更全面系統(tǒng)地評價檢測方法的可靠性。

1 材料與方法

1.1 試劑與原料

蘆?。兌取?5.0%），北京索萊寶科技有限公司提供；乙醇、氯化鋁、乙酸、乙酸鈉，均為分析純；桑葉，購自當?shù)厮幍辍?/p>

1.2 儀器與設備

AEY-220型分析天平，湘儀天平儀器設備有限公司產(chǎn)品；SB-25-12DT型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的制備

精密稱取蘆丁標準品10 mg，用60%乙醇溶解，定容至100 mL，即配制成質量濃度為100 μg/mL的標準溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

桑葉粉碎后過40目篩，以60%乙醇為溶劑，室溫（25℃）超聲輔助提取2次，每次30 min，料液比為1∶10（g∶mL），合并2次濾液得到樣品溶液。

1.3.3 檢測波長的確定

取2份1.3.1項中的標準溶液1 mL，分別置于2支10 mL的比色管中。其中，一份加入pH值5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液1 mL，用60%乙醇定容，為未顯色標準溶液；另一份加入5%三氯化鋁溶液1.5 mL，再加入pH值5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液1 mL，用60%乙醇定容，為顯色標準溶液。取2份1.3.2項中的樣液1 mL分別置于2支10 mL比色管中，同上法操作，分別為未顯色樣品溶液和顯色樣品溶液。以60%乙醇作為參比溶液，掃描上述4份溶液在190～700 nm波長范圍內(nèi)的紫外可見吸收光譜。

1.3.4 顯色條件對檢測結果的影響

（1）三氯化鋁添加量對吸光度的影響。分別取9份標準溶液1 mL和9份樣品溶液1 mL于10 mL比色管中，加入5%氯化鋁溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 mL，再加入pH值5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液1 mL，用60%乙醇定容。同時，制備空白組，以此作為參比溶液，測定波長于400 nm處的吸光度。

（2）緩沖液pH值對吸光度的影響。分別取5份標準品溶液1 mL和5份樣品溶液1 mL于10 mL比色管中，加入5%氯化鋁溶液1.5 mL，再加入pH值為2.5，3.5，4.5，5.5，6.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液1 mL，用60%乙醇定容。以空白作為參比溶液，測定波長于400 nm處的吸光度。

（3）顯色時間對吸光度的影響。取標準品溶液1 mL和樣品溶液1 mL于10 mL比色管中，分別加入5%氯化鋁溶液1.5 mL，再加入pH值5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液1 mL，用60%乙醇定容。以空白作為參比溶液，在顯色10，30，60，90，120 min時，測定波長于400 nm處的吸光度。

1.3.5 方法學研究

（1） 線性關系。分別取蘆丁標準溶液（質量濃度 100 μg/mL） 0，0.10，0.25，0.40，0.55，0.70，0.85，1.00，1.15，1.30，1.45，1.60 mL 于 10 mL 比色管中，依次加入5%的氯化鋁溶液1.5 mL，pH值5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液1 mL，用60%乙醇定容。以空白作為參比溶液，測定波長于400 nm處的吸光度。以質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制工作曲線，得出回歸方程。

（2）精密度。取1 mL標準溶液于10 mL比色管中，按照1.3.5（1） 項中方法進行顯色和測定吸光度。重復測定6次，計算相對標準偏差（RSD）。

（3）重復性。分別取6份1 mL樣品溶液于10 mL比色管中，按照1.3.5（1）項中方法進行顯色和測定吸光度，計算RSD。

（4） 加標回收率。取3組樣品溶液，分別加入一定量的標準溶液，按1.3.5（1）項中方法進行顯色和測定吸光度，每個加標量重復3次，根據(jù)標準曲線查出樣品溶液中總黃酮含量，計算平均加標回收率和RSD。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

標準品和樣品顯色前后紫外可見吸收光譜見圖1。

圖1 標準品和樣品顯色前后紫外可見吸收光譜

由圖1可知，加入氯化鋁顯色劑后，蘆丁最大吸收峰形移至波長400 nm處，而樣品溶液在波長400 nm處吸光度也明顯增大，并略顯峰形，因此選擇波長400 nm作為檢測波長。值得一提的是，以60%乙醇作為參比溶液，未顯色的樣品溶液在波長400 nm處本底吸光度較大，未顯色的對照品溶液也有一定的吸光度值，因此需要考慮溶液本底吸光度對檢測結果的干擾。在后續(xù)研究中，以未加顯色劑的溶液（空白）作為檢測的參比溶液，測定波長400 nm處的吸光度。

2.2 三氯化鋁用量的確定

5%氯化鋁溶液用量對標準品和樣品吸光度的影響見圖2。

圖2 5%氯化鋁溶液用量對標準品和樣品吸光度的影響

由圖2可知，隨著5%氯化鋁溶液用量的增加，蘆丁標準品吸光度較為穩(wěn)定，而樣品的吸光度緩慢下降，為提高檢測靈敏度和穩(wěn)定性，5%氯化鋁顯色劑溶液用量以1.5 mL為宜。

2.3 緩沖液pH值的確定

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液pH值對標準品和樣品吸光度的影響見圖3。

圖3 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液pH值對標準品和樣品吸光度的影響

由圖3可知，緩沖液pH值2.5～5.5時標準品和樣品的吸光度都呈緩慢增加趨勢，pH值6.5時吸光度增加幅度較大。兼顧檢測靈敏度和穩(wěn)定性，在后續(xù)研究中，選擇pH值5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液。

2.4 顯色時間的確定

顯色時間對標準品和樣品吸光度的影響見圖4。

圖4 顯色時間對標準品和樣品吸光度的影響

由圖4可知，在顯色10～30 min內(nèi)，標準品和樣品的吸光度變化略為明顯，二者變化趨勢不一致，前者略顯下降，后者略顯升高；而在30～120 min內(nèi)，標準品和樣品的吸光度都比較穩(wěn)定。因此，顯色30 min進行測定。

2.5 線性關系

蘆丁標準曲線見圖5。

圖5 蘆丁標準曲線

由圖5可知，在1～16 μg/mL質量濃度范圍內(nèi)，吸光度與蘆丁質量濃度呈良好的線性關系，回歸方程為 Y=0.029 8X-0.001 8（R2=0.999 5）。

2.6 精密度

按1.3.5中的方法重復測定6次，得到標準品吸光度分別為 0.287，0.286，0.286，0.286，0.288，0.287，計算相對標準偏差RSD為0.28%。可見，儀器精密度良好。

2.7 重復性

按1.3.5中的方法測定6份樣品溶液吸光度分別為 0.122，0.124，0.122，0.122，0.124，0.124，計算相對標準偏差（RSD）為0.89%?？梢?，方法的重復性良好。

2.8 加標回收率

加標回收率結果見表1。

表1 加標回收率結果

平均回收率為100.44%（RSD=0.92%），回收率良好。

3 結論

采用三氯化鋁顯色法測定桑葉提取物總黃酮含量，適宜的檢測條件為檢測波長400 nm，顯色劑5%，氯化鋁溶液用量1.5 mL，乙酸-乙酸鈉緩沖液pH值5.5，顯色30 min進行測定。以蘆丁為標準品，在1～16 μg/mL質量濃度范圍內(nèi)，吸光度與質量濃度呈良好的線性關系，相關系數(shù)R2=0.999 5，精密度（RSD=0.28%） 和重復性（RSD=0.89%） 良好，平均加標回收率為100.44%（RSD=0.92%），回收率良好。此法適于測定桑葉提取物總黃酮含量，可為相關研究提供檢測依據(jù)。

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