孟鵬舉，朱振元，張翥妮，楊 凡，張金豫，李 盟

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

滑子菇是珍稀品種，且產(chǎn)量大，具有味道美味、營養(yǎng)豐富的特點(diǎn)。滑子菇黏液對腫瘤有一定抑制作用。黏液中包含黃酮，具有預(yù)防大腸桿菌、葡萄球菌等多種細(xì)菌感染的作用[1]。黃酮的功效是多方面的，它是一種很強(qiáng)的抗氧劑，可有效清除體內(nèi)的氧自由基，黃酮化合物是一類重要的并且在植物界分布很廣的天然化合物[2]。此類物質(zhì)對多種疾病有良好的療效，醫(yī)用價值甚高[3]。醇提法效率高、成本低，且能將樣品里的有效活性成分大量提取出來[4]。試驗(yàn)利用醇提法通過控制料液比、提取時間、超聲波功率等因素來提取滑子菇活性成分，完成提取優(yōu)化工藝過程[5]。經(jīng)紫外分光光度計進(jìn)行全波長掃描后，比對波長初步判定滑子菇醇提物中黃酮含量較高，再經(jīng)顯色反應(yīng)進(jìn)一步確定黃酮的存在，從而展開滑子菇黃酮的抗氧化活性和抑菌試驗(yàn)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮滑子菇，市售；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、鄰苯三酚、抗壞血酸、氯化鈉、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂均為分析純，天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠提供；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），梯希愛（上海） 化成工業(yè)發(fā)展有限公司提供；Tris，美國Sigma公司提供；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海時代生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ－400KDB型超聲波清洗儀，沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司產(chǎn)品；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；DZF-6020型真空干燥箱，上海益恒科技有限公司產(chǎn)品；SP-2102UV型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；GHX-9160B-1型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)安泰公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 滑子菇黃酮提取

取50 g新鮮滑子菇[6]，按一定料液比，加入乙醇溶液后在一定的超聲波功率和時間下進(jìn)行提取，得到滑子菇黃酮[7]。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸后，得到固體滑子菇黃酮粗品。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

（1） 乙醇體積分?jǐn)?shù)對滑子菇黃酮得率的影響。分別設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%，30%，50%，70%，90%的5個平行試驗(yàn)，在超聲波功率250 W，料液比1∶5（g∶mL） 的條件下處理0.5 h，然后測定滑子菇黃酮得率。

（2）提取時間對滑子菇黃酮得率的影響。分別設(shè)置提取時間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h的5個平行試驗(yàn)，在超聲功率250 W，料液比1∶5（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)50%的條件下處理，然后測定滑子菇黃酮得率。

（3）超聲功率對滑子菇黃酮得率的影響。分別設(shè)置超聲功率為250，360，480，560，720 W 5個平行試驗(yàn)，在料液比1∶5（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)50%的條件下處理0.5 h，然后測定滑子菇黃酮得率。

（4）料液比對滑子菇黃酮得率的影響。分別設(shè)置料液比為 1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7 （g∶mL）的5個平行試驗(yàn)，在超聲波功率250 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%的條件下處理0.5 h，然后測定滑子菇黃酮得率。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計

在4個單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，考查乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、超聲功率和料液比4個因素，根據(jù)L9（34）的設(shè)計正交試驗(yàn)，從而優(yōu)化滑子菇醇提提取條件[8-9]。

正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.4 紫外分光光度計全波長掃描

利用紫外分光光度計全波長掃描法[10]對醇提物進(jìn)行全波段掃描，測定條件為掃描波長段150～800 nm，掃描高度-0.1～5.0 A，掃描速度1 800 nm/min。

1.3.5 黃酮的顏色反應(yīng)

黃酮類化合分子可與鋁鹽、鎂鹽等反應(yīng)生成絡(luò)合物[11]。取1支試管，加入新鮮配置的1%三氯化鋁溶液2 mL和10 mg/mL的樣品溶液2 mL，靜置數(shù)分鐘觀察顏色變化。

1.3.6 AlCl3顯色法[12]測定滑子菇黃酮含量

（1） 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。依據(jù)文獻(xiàn)方法[13]，配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，分別精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，以體積分?jǐn)?shù)35%乙醇補(bǔ)足至5.0 mL，加入1%AlCl3溶液4 mL，用體積分?jǐn)?shù)35%乙醇定容，以第1個管為空白對照，于415 nm處測定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。

（2）黃酮含量的測定。精確量取質(zhì)量濃度10mg/mL滑子菇黃酮粗品溶液1 mL，按照1.3.6（1） 的方法操作[15]，于415 nm處測定吸光度，帶入線性回歸方程，計算出滑子菇黃酮粗品中總黃酮含量。

（3） D-101型大孔樹脂法純化黃酮。根據(jù)文獻(xiàn)方法[16]，預(yù)處理大孔吸附樹脂。大孔吸附樹脂純化流程：預(yù)處理的D-101型大孔吸附樹脂50 mL裝柱，70%乙醇溶液200 mL洗脫前提下，洗脫體積流量2.0 BV/h，滑子菇黃酮質(zhì)量濃度10 mg/mL，pH值6.0。

（4） 純化后黃酮含量測定。收集1.3.6（3） 中乙醇洗脫流出液，在干燥箱中烘干后得到固體黃酮，精確量取1 g固體黃酮，溶于100 mL無水乙醇，制成10 mg/mL樣品溶液，用1.3.6（2） 的方法測定滑子菇黃酮粗品純化后總黃酮含量[17]。

1.3.7 對羥基自由基的清除作用

采用可見分光光度法[18]，在比色皿中依次加入濃度為9 mmol/L FeSO4溶液2 mL，濃度為9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL，滑子菇黃酮2 mL，濃度為8.8 mmol/L H2O2溶液2 mL，其中H2O2啟動整個反應(yīng)[19]。于37℃條件下反應(yīng)0.5 h。用蒸餾水代替滑子菇黃酮作空白，在510 nm處測定樣品吸光度，記錄數(shù)據(jù)。

式中：Ax——樣品液清除自由基吸光度；

A0——空白對照的吸光度；

Ax0——不加水楊酸時提取液自身的吸光度。

1.3.8 對DPPH自由基的清除作用

配置0.5 mg/mL的VC溶液（作為對照）[20]。將測試樣品稀釋至5個不同質(zhì)量濃度。取2 mL滑子菇黃酮溶液及濃度為0.1 mmol/L DPPH自由基溶液2 mL加入到同一試管中，室溫下靜置30 min后測定其吸光度Asample，同時測定2 mL DPPH溶液與2 mL溶劑混合后的吸光度Acontrol，以及2 mL滑子菇黃酮樣品溶液與2 mL無水乙醇混合后的吸光度Ablank。

1.3.9 對超氧陰離子自由基的清除作用

取4.5 mL Tris-HCl（pH值8.2） 緩沖液加4.2 mL蒸餾水，于25℃條件下水浴保溫20 min，加到25℃預(yù)熱0.3 mL的3 mmol/L鄰苯三酚溶液中，于325 nm處每隔30 s測A值1次，共測5 min，計算對照溶液吸光度隨時間的變化率F0。以1 mL滑子菇黃酮溶液替代1 mL蒸餾水，計算滑子菇黃酮溶液吸光度隨時間的變化率Fx。以10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚作為空白[21]。

1.3.10 滑子菇黃酮對細(xì)菌抑菌特性的研究

（1） 菌種的活化培養(yǎng)[22]。預(yù)先將4種供試菌（大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）接種于適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，然后制成一系列菌懸液，濃度約為107CFU/mL備用。

圖1 各種因素對滑子菇黃酮得率的影響

（2） 肉湯固體培養(yǎng)基。牛肉膏2.5 g，蛋白胨5 g，NaCl 2.5 g，水 500 mL，瓊脂 10 g，pH 值 7.2～7.4。滅菌條件為121℃，20 min。

（3）滑子菇黃酮的抑菌活性測定。分別制備質(zhì)量濃度依次為8，16，32，64 mg/mL的樣品，利用紙片法，對4種供試菌進(jìn)行試驗(yàn)，傾倒平板后于37℃條件下培養(yǎng)24 h，檢測抑菌活性情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析結(jié)果

各因素對滑子菇黃酮得率的影響見圖1。

由圖1（a） 可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷增大，滑子菇黃酮的得率呈現(xiàn)先減小后逐漸增大的趨勢線。當(dāng)最大體積分?jǐn)?shù)為90%時，滑子菇黃酮得率最大。在正交試驗(yàn)中選取50%，70%，90%這3個對滑子菇黃酮得率影響最大的水平。由圖1（b）可知，隨著提取時間的延長，滑子菇黃酮得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在提取時間為1.5 h時滑子菇黃酮得率達(dá)到最大值，選取1.0，1.5，2.0 h為宜。由圖1（c） 可知，在料液比1∶5時滑子菇黃酮得率最大?？赡苁且?yàn)樵?∶5的料液比的情況下，乙醇提取液相對于滑子菇黃酮差不多達(dá)到飽和的狀態(tài)，選1∶5，1∶6，1∶7（g∶mL） 較合適。由圖 1（d） 可知，隨著超聲功率的不斷增加，滑子菇黃酮得率在不斷增加，但是增長率在不斷下降甚至趨向于零，選取480，560，720 W為宜。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、料液比、超聲波功率為4個因素，進(jìn)行四因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化滑子菇黃酮醇提的工藝條件。

正交試驗(yàn)分析結(jié)果見表2。

由表2可知，4個因素對滑子菇黃酮得率的影響順序?yàn)锽＞C＞A＞D。超聲功率和提取時間對滑子菇黃酮得率的影響較大，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對滑子菇黃酮得率的影響較小；滑子菇黃酮提取的最佳條件為A2B3C1D1，對此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得率為2.989%，高于正交試驗(yàn)設(shè)計中的組合，因此確定滑子菇黃酮醇提的最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時間2 h，料液比1∶5，超聲波功率480 W。

2.3 紫外分光光度計全波長掃描結(jié)果

滑子菇醇提物全波長掃描見圖2。

由圖2可以看出，滑子菇醇提物經(jīng)過紫外分光光度計全波長掃描后，在190～230 nm出現(xiàn)吸收峰，在250～800 nm處無明顯吸收峰。多糖吸收波長在562～630 nm，大部分黃酮類化合物的特征吸收在200～300 nm，所以可以初步確定滑子菇醇提物成分中含有黃酮。

2.4 黃酮顏色反應(yīng)結(jié)果

樣品溶液與1%AlCl3溶液反應(yīng)后，溶液顏色變?yōu)辄S色，并生成黃色絡(luò)合物，符合黃酮類化合物顯色反應(yīng)結(jié)果，表明滑子菇醇提物成分中確實(shí)含有黃酮類化合物。

2.5 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)可得到如圖3所示的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)分別為Y=0.104 1X+0.000 5，R2=0.998 4。由此可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在0～0.08 mg/mL的質(zhì)量濃度呈較良好的線性關(guān)系。

2.6 黃酮含量測定結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)和2.5中回歸方程，計算出滑子菇黃酮粗品中總黃酮含量為3.29%。

2.7 純化后黃酮含量測定結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)和2.5中回歸方程，計算出滑子菇

黃酮粗品純化后總黃酮含量為41.47%。

2.8 滑子菇黃酮抗氧化活性的測定結(jié)果分析2.8.1 DPPH自由基清除率的測定結(jié)果

DPPH自由基清除率見表3。

表3 DPPH自由基清除率

由表3可知，隨著滑子菇黃酮質(zhì)量濃度的升高，不同質(zhì)量濃度之間存在顯著性差異（p＜0.05）。質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，滑子菇黃酮對DPPH自由基的清除率升高到78.09%。結(jié)果表明，滑子菇黃酮對DPPH自由基具有很好的清除能力。

2.8.2 羥基自由基（·OH）清除率的測定結(jié)果

羥基自由基（·OH） 清除率見表4。

表4 羥基自由基（·OH） 清除率

由表4可知，滑子菇黃酮對羥基自由基的清除作用隨著質(zhì)量濃度的增長，逐漸變大，但清除率較低。其清除作用在其質(zhì)量濃度為10 mg/mL時為5.60%，明顯差于VC。這說明滑子菇黃酮對羥基自由基有一定的清除作用，但清除能力不強(qiáng)。

2.8.3 超氧陰離子自由基（O2-）清除率的測定結(jié)果

試驗(yàn)數(shù)據(jù)：F0=0.067 8；Fx1=0.103 1；Fx2=0.093 8；Fx3=0.084 8；Fx4=0.075 8；Fx5=0.062 7 （x1～x5分別代表滑子菇醇提物的質(zhì)量濃度10～50 mg/mL）。說明雖然F值即變化率隨著滑子菇黃酮質(zhì)量濃度在逐漸降低，但是Fx值始終比F0的值要大，這也就是說明，滑子菇黃酮對于超氧陰離子自由基并無清除作用。

2.9 滑子菇黃酮對細(xì)菌抑菌特性的研究結(jié)果

觀察平板，結(jié)果顯示在涂布有大腸桿菌菌懸液的平板上出現(xiàn)了明顯抑菌圈，且樣品溶液濃度越大，抑菌效果越明顯，而涂布有其他3種細(xì)菌菌懸液的平板上無抑菌圈出現(xiàn)。說明滑子菇黃酮對大腸桿菌有明顯抑菌作用，對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌這3種細(xì)菌沒有抑菌效果。

3 結(jié)論

（1）試驗(yàn)對新鮮滑子菇黃酮的醇提條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)分析和正交試驗(yàn)分析，得到最優(yōu)醇提條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時間2 h，超聲功率480 W，料液比1∶5（g∶mL），此條件下滑子菇黃酮的得率最大，為2.989%。

（2）用紫外分光光度法將滑子菇醇提物進(jìn)行全波長掃描后，初步判定滑子菇醇提物的成分主要是黃酮，再經(jīng)顏色反應(yīng)鑒定，驗(yàn)證了黃酮的存在。滑子菇黃酮在醇提后得到滑子菇黃酮粗品，粗品中總黃酮含量為3.29%，經(jīng)D-101型大孔吸附樹脂精制后，其總黃酮含量為41.47%。

（3）在進(jìn)行抗氧化活性試驗(yàn)中，當(dāng)滑子菇黃酮質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，DPPH自由基的清除率為78.09%；當(dāng)滑子菇醇提物質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，羥基自由基的清除率為5.60%；滑子菇黃酮對超氧陰離子無清除作用。綜上說明，滑子菇黃酮有一定的清除自由基、抗氧化的能力，但是均弱于抗壞血酸。

（4） 對滑子菇黃酮進(jìn)行細(xì)菌抑菌特性的研究，滑子菇黃酮對大腸桿菌有明顯抑菌作用，且黃酮濃度越大，抑菌效果越明顯，對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌這3種細(xì)菌沒有抑菌效果。

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