鐘文津，楊炳昂，景香香，張潔，方小麗，王丹丹，劉麗莉，王可環(huán)

(海南省人民醫(yī)院，?？?70311)

越來越多的研究顯示在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中存在急慢性炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞和炎癥因子的過度活化與動脈粥樣硬化進(jìn)展和斑塊破裂密切相關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)失衡是造成動脈粥樣硬化進(jìn)展的重要原因[2,3]。阿托伐他汀是治療動脈粥樣硬化的主要藥物，效果明確，但其對Th17、Treg的影響研究較少。本研究觀察了頸動脈粥樣硬化患者外周血Th17、Treg比例變化，探討阿托伐他汀干預(yù)對Th17、Treg的影響。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2016年2月～2017年1月我院收治的頸動脈粥樣硬化患者80例，男44例、女36例，年齡39～75(57.6 ± 8.1)歲，合并高血壓39例、糖尿病29例、高脂血癥28例，頸動脈內(nèi)中膜厚度(IMT)1.3～4.1(2.4±1.1)mm。納入標(biāo)準(zhǔn)：行頸動脈超聲檢查證實(shí)存在斑塊，性質(zhì)為軟斑塊(超聲呈均質(zhì)或不規(guī)則低回聲)；IMT>1.2 mm。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有腦梗死、腦出血、急性心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛或血管畸形；近4周內(nèi)服用非甾體抗炎藥、激素、免疫抑制劑或他汀類藥物；合并嚴(yán)重的心肝腎功能障礙、免疫系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕性疾病或腫瘤；合并感染性疾病或發(fā)熱；妊娠及哺乳期婦女；不能配合檢查者。將患者隨機(jī)分為阿托伐他汀組和常規(guī)治療組，每組40例。另選同期體檢健康者40例作為健康組，其中男20例、女20例，年齡37～75(56.1±9.0)歲。三組年齡、性別均具有可比性。

1.2治療方法阿托伐他汀組和常規(guī)治療組均積極控制基礎(chǔ)疾病，給予降壓、控制血糖等常規(guī)治療。在此基礎(chǔ)上阿托伐他汀組口服阿托伐他汀鈣片40 mg/d。兩組均連續(xù)治療3個(gè)月。

1.3外周血Th17、Treg檢測阿托伐他汀組及常規(guī)治療組分別于治療前及治療3個(gè)月結(jié)束時(shí)，健康組于體檢時(shí)，分別采集空腹靜脈血，制備單淋巴細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞儀(FACS Aria Ⅲ 型，美國BD公司)檢測Th17、Treg，計(jì)算Treg/Th17。

1.3.1單淋巴細(xì)胞懸液制備取一支15 mL離心管，加入5 mL Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，吸取5 mL血液標(biāo)本置于分離液中，500 g離心30 min；吸取第二層的環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層，加入到另一15 mL離心管中，加入10 mL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，混勻后250 g離心10 min，棄上清，加入5 mL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，250 g離心10 min，棄上清，加入5 mL PBS緩沖液洗滌細(xì)胞；將細(xì)胞重懸于含有10%二甲基亞砜(DMSO)的FBS中，-80 ℃冰箱內(nèi)過夜，液氮保存。

1.3.2Th17檢測解凍上述淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.0×106個(gè)/mL，取200 μL單細(xì)胞懸液接種于24孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；收集細(xì)胞，等分為測定管和對照管，各加入20 μL FITC-CD4抗體，避光4 ℃孵育30 min；加入1 mL破膜劑，避光4 ℃孵育45 min；測定管中加入20 μL PE標(biāo)記的IL-17抗體，對照管中加入同等劑量的同型對照抗體，避光4 ℃孵育30 min；采用流式細(xì)胞儀檢測Th17，計(jì)算比例。

1.3.3Treg檢測取200 μL單細(xì)胞懸液分別加入到測定管和對照管中，再分別加入20 μL FITC-CD4抗體，測定管中加入5 μL APC-CD25抗體，對照管中加入同等劑量的同型對照抗體，避光4 ℃孵育30 min；加入1 mL破膜劑，避光4 ℃孵育45 min；測定管中加入20 μL PE-Foxp3抗體，對照管中加入同等劑量的同型對照抗體，避光4 ℃孵育30 min；采用流式細(xì)胞儀檢測Treg，計(jì)算比例。

1.4血漿維甲酸受體相關(guān)的孤兒受體(ROR-γt)、叉頭翼螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)mRNA表達(dá)檢測采用RT-PCR法。取各組血液樣本，采用TRIzol法提取總RNA；合成第一鏈cDNA；構(gòu)建熒光定量PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min、95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、68 ℃ 55 s(40個(gè)循環(huán))。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算ROR-γt、Foxp3 mRNA相對表達(dá)量。ROR-γt上游引物：CCTGGGCTCCTCGCCTGACC，下游引物：TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC。Foxp3上游引物：CTGGCAAATGGTGTCTGCAAGT，下游引物：TGGCACCCAGCACAATGAA。

1.5血清IL-17、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)檢測取1.4中采集的外周血液樣本，離心后取血清，采用ELISA法檢測IL-17、TGF-β。具體步驟參照試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)說明書。

2　結(jié)果

2.1三組外周血Th17、Treg比例及Treg/Th17比較見表1。

表1　　　　三組外周血Th17、Treg比例及Treg/Th17比較

注：與健康組比較，*P<0.05；與常規(guī)治療組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05；與同組治療前比較，#P<0.05。

2.2三組血漿ROR-γt、Foxp3 mRNA表達(dá)比較見表2。

表2　　　　三組血漿ROR-γt、Foxp3 mRNA相對表達(dá)量比較

注：與健康組比較，*P<0.05；與常規(guī)治療組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05；與同組治療前比較，#P<0.05。

2.3三組血清IL-17、TGF-β水平比較見表3。

表3　三組血清IL-17、TGF-β水平比較

注：與健康組比較，*P<0.05；與常規(guī)治療組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05；與同組治療前比較，#P<0.05。

3　討論

Th17和Treg是一組起源相同、分化差異的T細(xì)胞亞群，具有互相調(diào)節(jié)、互相抑制的作用，是除Th1/Th2外的另一組免疫調(diào)控細(xì)胞。Th17屬于效應(yīng)性T細(xì)胞，通過分泌IL-17、TNF-α等炎癥因子，促進(jìn)病理性免疫反應(yīng)的激活。Treg具有免疫無能和免疫抑制兩大特性，能夠抑制免疫細(xì)胞增殖和免疫活性，抑制炎癥反應(yīng)。研究證實(shí)，Th17/Treg失衡在炎癥性腸病、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及部分腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[4～6]。Gao等[7]研究顯示，ApoE-/-小鼠體內(nèi)Th17比例升高，轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt和效應(yīng)分子IL-17表達(dá)量也升高，證實(shí)Th17比例增加促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的形成。臨床研究發(fā)現(xiàn)，急性冠脈綜合征患者外周血中Th17比例及IL-17表達(dá)量增高，說明Th17細(xì)胞數(shù)量增加與斑塊不穩(wěn)定性相關(guān)[8]。

Treg是一種負(fù)向調(diào)控免疫細(xì)胞，具有抑制炎癥反應(yīng)、保持免疫耐受、維持免疫狀態(tài)平衡等效應(yīng)，其表達(dá)量降低可導(dǎo)致機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)遭到破壞，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)激活。Treg主要分泌TGF-β和IL-10，抑制和下調(diào)IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白、細(xì)胞間黏附分子等炎癥因子表達(dá)，減少炎性細(xì)胞積聚，延緩動脈粥樣硬化形成[9]。Treg還可加快低密度脂蛋白和乳糜微粒的分解，下調(diào)膽固醇水平，減輕高血脂對巨噬細(xì)胞的刺激，抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化和斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞增殖[10]。Li等[11]研究顯示，外周血Treg比例下降及Th17/Treg失衡是動脈粥樣硬化斑塊破裂的危險(xiǎn)因素。賈寧等[12]研究證實(shí)，外周血Treg數(shù)量可以反映動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。

本研究80例頸動脈粥樣硬化患者頸動脈斑塊均為軟斑塊，與健康組相比，患者外周血Th17比例升高，Treg比例下降，Th17/Treg失衡；對其下游的效應(yīng)分子進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，Th17分泌的ROR-γt、IL-17 mRNA表達(dá)量升高，Treg分泌的Foxp3、TGF-β mRNA表達(dá)量降低。提示頸動脈軟斑患者體內(nèi)存在Th17、Treg失衡。

他汀類藥物是治療動脈粥樣硬化的常規(guī)藥物，但其對Th17、Treg數(shù)量影響的研究較少。有研究顯示，給予ApoE-/-小鼠辛伐他汀處理后，斑塊內(nèi)Treg數(shù)量增加，F(xiàn)oxp3、IL-10和TGF-β mRNA及蛋白表達(dá)均增加，血液IL-17水平降低[13]。王治校等[14]研究認(rèn)為，阿托伐他汀能夠增加急性冠脈綜合征患者外周血Treg比例并增強(qiáng)其功能。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用阿托伐他汀后，阿托伐他汀組外周血Treg比例、Foxp3 mRNA表達(dá)量和TGF-β蛋白水平均較用藥前升高，Th17及其效應(yīng)分子表達(dá)量降低，提示阿托伐他汀有助于糾正Th17/Treg失衡。阿托伐他汀組術(shù)后Th17、Treg比例及其效應(yīng)分子水平與健康組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示3個(gè)月的阿托伐他汀治療尚不足以完全糾正Th17/Treg失衡，可能需更長時(shí)間的用藥，同時(shí)也需進(jìn)一步研究其他改善Th17/Treg失衡的治療方案。

綜上所述，頸動脈粥樣硬化患者外周血Th17比例增加，Treg比例降低，存在Th17/Treg失衡；阿托伐他汀治療有助于糾正Th17/Treg失衡。

參考文獻(xiàn)：

[1] Pant S, Deshmukh A, Gurumurthy GS, et al. Inflammation and atherosclerosis--revisited[J]. J Cardiovasc Pharmacol Ther, 2014,19(2):170-178.

[2] Taleb S, Tedgui A, Mallat Z. IL-17 and Th17 cells in atherosclerosis: subtle and contextual roles[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2015,35(2):258-264.

[3] Chistiakov DA, Sobenin IA, Orekhov AN. Regulatory T cells in atherosclerosis and strategies to induce the endogenous atheroprotective immune response[J]. Immunol Lett, 2013,151(1-2):10-22.

[4] Park BV, Pan F. The role of nuclear receptors in regulation of Th17/Treg biology and its implications for diseases[J]. Cell Mol Immunol, 2015,12(5):533-542.

[5] 尤亞紅.調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞/輔助性T淋巴細(xì)胞17失衡在自身免疫性疾病中的研究進(jìn)展[J].國際輸血及血液學(xué)雜志,2015,38(6):541-545.

[6] Butcher MJ, Gjurich BN, Phillips T, et al. The IL-17A/IL-17RA axis plays a proatherogenic role via the regulation of aortic myeloid cell recruitment[J]. Circ Re, 2012,110(5):675-687.

[7] Gao Q, Jiang Y, Ma T, et al. A critical function of Th17 proinflammatory cells in the development of atherosclerotic plaque in mice[J]. J Immunol, 2010,185(10):5820-5287.

[8] Li Q, Wang Y, Wang Y, et al. Treg/Th17 ratio acts as a novel indicator for acute coronary syndrome[J]. Cell Biochem Biophys, 2014,70(2):1489-1498.

[9] Ghourbani GS, Andalib A, Hashemi M, et al. CD4+Foxp3+Treg and its ICOS+subsets in patients with myocardial infarction[J]. Iran J Immunol, 2012,9(1):53-60.

[10] Klingenberg R, Gerdes N, Badeau RM, et al. Depletion of FOXP3+regulatory T cells promotes hypercholesterolemia and atherosclerosis[J]. J Clin Invest, 2013,123(3):1323-1334.

[11] Li Q, Wang Y, Wang Y, et al. Distinct different sensitivity of Treg and Th17 cells to Fas-mediated apoptosis signaling in patients with acute coronary syndrome[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2013,6(2):297-307.

[12] 賈寧,韓錕,閔連秋.腦梗死患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平與頸動脈粥樣硬化的相關(guān)性[J].中國動脈硬化雜志,2014,22(7):715-717.

[13] Meng X, Zhang K, Li J, et al. Statins induce the accumulation of regulatory T cells in atherosclerotic plaque[J]. Mol Med, 2012,9(18):598-605.

[14] 王治校,王潔,何茜,等.急性冠脈綜合征患者體內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化及阿托伐他汀對其影響[J].湖北醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào),2017,36(1):40-44.