顧杰林，李正華，葉翀

(貴港市人民醫(yī)院，廣西貴港537100)

舌鱗狀細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱舌鱗癌)的發(fā)生位置血管及淋巴管非常豐富，故腫瘤細(xì)胞易于轉(zhuǎn)移[1,2]，患者預(yù)后較差。細(xì)胞偽足的形成被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲性的標(biāo)志之一[3，4]。侵襲性偽足的功能主要為通過(guò)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族降解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而調(diào)控上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[5]。已有文獻(xiàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)誘導(dǎo)的EMT過(guò)程能促進(jìn)侵襲性偽足的形成和腫瘤轉(zhuǎn)移[6]。潛伏轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β結(jié)合蛋白1(LTBP1)被認(rèn)為是TGF-β誘導(dǎo)EMT通路中重要的調(diào)控因子。2017年1～10月，我們觀察了LTBP4過(guò)表達(dá)對(duì)舌鱗癌細(xì)胞侵襲能力的影響，現(xiàn)分析結(jié)果，探討LTBP4在舌鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1　材料與方法

1.1材料舌鱗癌細(xì)胞系TCA8113購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，DMEM與FBS購(gòu)自美國(guó)Gibico公司，LTBP4、E鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、鋅指E盒結(jié)合蛋白1(ZEB1)、鋅指蛋白(Slug)一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signal Techology，二抗購(gòu)自北京中杉金橋有限公司，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Gelatin購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。質(zhì)粒的構(gòu)建由漢恒生物技術(shù)有限公司完成。

1.2CON與LTBP4過(guò)表達(dá)腺病毒構(gòu)建CON質(zhì)粒為空載穿梭pHBAd-CMV-IRES-GFP質(zhì)粒。LTBP4 CDS序列首先使用PCR合成，模板為293t cDNA，引物序列為Sense: 5′-GTCGACACCGGTATGCCGAGGCCTGGCACCAG-3′，Antisense: 5′-GATAGAAAATAGGTGGTTTTTTAGCTATAGCTA-3′。在合成LTBP4后，首先克隆至pHBAd-CMV-IRES-GFP得到LTBP4-pHBAd-CMV-IRES-GFP穿梭質(zhì)粒，將2 μg穿梭質(zhì)粒、4 μg p-BHG(delta)E1,3 cre腺病毒基因組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入接種于6 cm2平皿的293A細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染方式為L(zhǎng)ipofectamine2000，步驟根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染10天形成病毒空斑，挑起空斑移入新的平皿中，進(jìn)行擴(kuò)增，隨后收集感染病毒細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，裂解細(xì)胞得到第一代細(xì)胞；進(jìn)一步擴(kuò)增，待形成第四代細(xì)胞時(shí)行大量擴(kuò)增(30個(gè)10 cm2平皿)；隨后反復(fù)凍融細(xì)胞得到病毒，使用氯化銫梯度離心法純化腺病毒，2 000 r/min離心2 h，取2.0 mL 1.40 g/mL與3.0 mL 1.30 g/mL中間乳白色條帶，加入透析袋中，4 ℃過(guò)夜，得到LTBP4過(guò)表達(dá)腺病毒。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理TCA8113細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2孵箱中，培養(yǎng)基為DMEM+10% FBS。培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞分為對(duì)照組與LTBP4組，分別感染CON與LTBP4過(guò)表達(dá)腺病毒，感染復(fù)數(shù)(病毒數(shù)∶細(xì)胞數(shù))為100 MOI，感染48 h，換液并行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1細(xì)胞LTBP4蛋白表達(dá)采用Western blotting法。RIPA裂解細(xì)胞后，加入0.2倍體積的5×loading buffer，煮沸15 min后加入預(yù)制膠中，50 V電泳20 min，待marker分開(kāi)時(shí)將電壓加至120 V，恒壓電泳至溴酚藍(lán)跑到膠板底部，濕法將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入LTBP4一抗(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗，加入二抗(1∶500)，37 ℃孵育2 h，PBS漂洗3次，ECL液顯色，計(jì)算各電泳條帶灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。結(jié)果顯示，LTBP4組LTBP4 蛋白相對(duì)表達(dá)量為24.31±5.87，高于對(duì)照組的1.00±0.22(P<0.01)，提示轉(zhuǎn)染成功。

1.4.2細(xì)胞侵襲能力采用Transwell小室法。將兩組細(xì)胞重懸于200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中，加入Transwell上室，同時(shí)在下室加入500 μL完全培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS)，12 h后上室正面使用PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，風(fēng)干Transwell小室，并使用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，棉簽拭去上室正面細(xì)胞，顯微鏡拍攝上室背面遷移細(xì)胞，使用Image J軟件計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.3細(xì)胞基質(zhì)降解能力采用基質(zhì)膠降解實(shí)驗(yàn)。首先將200 μL 50 μg/mL多聚賴氨酸鋪于激光共聚焦小皿，室溫靜置20 min；PBS洗2遍，加入200 μL 0.5%戊二醛，室溫靜置15 min；PBS洗2遍，加入200 μL Gelatin膠，室溫靜置15 min；加入200 μL 5 mg/mL四氫硼酸鈉，PBS洗2遍后即得到Gelatin pig oregon green 488激光共聚焦小皿。兩組細(xì)胞血清饑餓處理后，使用TGF-β(2 ng/mL)誘導(dǎo)24 h，4%多聚甲醛固定20 min，0.2% TRIton-X 100破膜，5% FBS室溫封閉30 min，加入5 μg/mL Tritc-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞骨架，加入DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。激光共聚焦顯微鏡觀察基質(zhì)膠降解情況，Image J軟件計(jì)算基質(zhì)膠的降解面積。

1.4.4細(xì)胞侵襲性偽足形成情況采用熒光共聚焦顯微鏡觀察。將兩組細(xì)胞鋪于激光共聚焦小皿中，待細(xì)胞貼壁后，4%多聚甲醛固定，使用0.2% TRIon-X 100破膜，5% FBS封閉，加入兔抗cortactin抗體(1∶400)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入抗兔的綠色熒光標(biāo)記二抗(1∶400)，DAPI染核，PBS洗2遍，激光共聚焦顯微鏡觀察兩組細(xì)胞，以出現(xiàn)cortactin陽(yáng)性顆粒作為出現(xiàn)侵襲性偽足的指標(biāo)，計(jì)算侵襲偽足出現(xiàn)的細(xì)胞比例。

1.4.5E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug蛋白表達(dá)采用Western blotting法。具體方法及結(jié)果計(jì)算均參照1.4.1。E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug、GAPDH一抗?jié)舛染鶠?∶200。

2　結(jié)果

2.1兩組侵襲能力比較LTBP4組侵襲細(xì)胞數(shù)為(139±32)個(gè)，對(duì)照組為(343±49)個(gè)，組間比較P<0.01。

2.2兩組基質(zhì)降解能力比較LTBP4組基質(zhì)膠降解面積為(412.4 ±72.1)μm2，對(duì)照組為(1 123±82.3)μm2，組間比較P<0.01。

2.3兩組侵襲性偽足形成情況比較LTBP4組侵襲性偽足出現(xiàn)的細(xì)胞比例為(7.23±3.12)%，對(duì)照組為(18.24±2.31)%，組間比較P<0.01。

2.4兩組E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug蛋白表達(dá)比較見(jiàn)表1。

表1　　　　兩組E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3　討論

LTBP家族是一種EMT糖蛋白，其主要功能為結(jié)合TGF-β，促進(jìn)TGF-β的正確組裝及運(yùn)輸[5,6]。LTBP與TGF-β在經(jīng)過(guò)特定的蛋白酶或其他因素解離后才能被活化[7,8]。LTBP家族最受關(guān)注的功能為通過(guò)與TGF-β結(jié)合調(diào)控TGF-β通路。LTBP包括1、2、3、4 四種蛋白，盡管四種蛋白的結(jié)構(gòu)極為相似，但在腫瘤中的表達(dá)截然不同。其中，LTBP4主要在心肌、骨骼肌及平滑肌組織中高表達(dá)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，LTBP4在人與小鼠乳腺腫瘤組織中低表達(dá)[10]，通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但LTBP4與EMT通路及腫瘤細(xì)胞侵襲性之間的關(guān)系尚不明確。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，LTBP4在舌鱗癌組織中低表達(dá)，提示LTBP4低表達(dá)可能參與舌鱗癌的發(fā)生。本研究中我們首先構(gòu)建了LTBP4過(guò)表達(dá)腺病毒，并用該病毒感染舌鱗癌細(xì)胞TCA8113，Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示LTBP4組LTBP4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，提示LTBP4過(guò)表達(dá)腺病毒成功感染舌鱗癌細(xì)胞。進(jìn)一步通過(guò)Transwell檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LTBP4過(guò)表達(dá)可抑制舌鱗癌細(xì)胞侵襲。既往文獻(xiàn)報(bào)道，LTBP家族與EMT通路的關(guān)系密切[11]。E-cadherin、Vimentin、ZEB1、Slug均為EMT通路的關(guān)鍵因子，共同介導(dǎo)EMT過(guò)程。在EMT過(guò)程中，上皮表型標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)表型Vimentin表達(dá)上調(diào)；ZEB1和Slug作為E-cadherin轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)調(diào)控E-cadherin表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控EMT過(guò)程[12]。本研究結(jié)果顯示，LTBP4過(guò)表達(dá)可促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)，抑制Vimentin、ZEB1、Slug蛋白表達(dá)，提示LTBP4可抑制EMT過(guò)程。

在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，強(qiáng)侵襲性的腫瘤細(xì)胞可通過(guò)侵襲性偽足降解細(xì)胞外基質(zhì)從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移[13]。LTBP4已被證實(shí)能夠結(jié)合于細(xì)胞外基質(zhì)中的TGF-β，從而調(diào)控TGF-β的功能[14]。本研究采用基質(zhì)膠降解實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LTBP4過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)降解能力的影響，結(jié)果LTBP4組基質(zhì)膠降解面積顯著降低，初步證實(shí)了LTBP4過(guò)表達(dá)TCA8113細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)降解能力降低。進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光檢測(cè)侵襲性偽足標(biāo)記物cortactin表達(dá)，結(jié)果顯示對(duì)照組中出現(xiàn)圓形粗大的cortactin陽(yáng)性顆粒，并在細(xì)胞腹側(cè)面聚集，即認(rèn)為是侵襲性偽足[15]；本研究LTBP4過(guò)表達(dá)組該類(lèi)細(xì)胞顯著減少，提示LTBP4在改變EMT通路的同時(shí)，能夠通過(guò)影響舌鱗癌細(xì)胞侵襲性偽足的形成達(dá)到對(duì)細(xì)胞侵襲的調(diào)控。

綜上所述，LTBP4過(guò)表達(dá)可抑制舌鱗癌細(xì)胞侵襲；調(diào)控EMT信號(hào)通路，抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解與侵襲性偽足的形成可能是其作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1] Howard J, Masterson L, Dwivedi RC, et al. Minimally invasive surgery versus radiotherapy/chemoradiotherapy for small-volume primary oropharyngeal carcinoma [J]. Cochrane Database Syst Rev, 2016,11(12):CD010963

[2] O′Donnell RK, Feldman M, Mick R, et al. Immunohistochemical method identifies lymphovascular invasion in a majority of oral squamous cell carcinomas and discriminates between blood and lymphatic vessel invasion[J]. J Histochem Cytochem, 2008,56(9):803-810.

[3] Glogauer JE, Sun CX, Bradley G, et al. Neutrophils increase oral squamous cell carcinoma invasion through an invadopodia-dependent pathway[J]. Cancer Immunol Res, 2015,3(11):1218-1226.

[4] Hwang YS, Park KK, Chung WY. Epigallocatechin-3 gallate inhibits cancer invasion by repressing functional invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma[J]. Eur J Pharmacol, 2013,715(1):286-295.

[5] Honda Y, Takigawa N, Ichihara E, et al. Effects of (-)-epigallocatechin-3-gallate on EGFR-or Fusion Gene-driven Lung Cancer Cells[J]. Acta Medica Okayama, 2017,71(6):505-512.

[6] Moustakas A, Heldin CH. Mechanisms of TGFβ-induced epithelial-mesenchymal transition[J]. J Clin Med, 2016,5(7):63.

[7] Bultmann-Mellin I, Dinger K, Debuschewitz C, et al. Role of LTBP4 in alveolarization, angiogenesis, and fibrosis in lungs[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2017,313(4):L687-L698.

[8] Wan F, Peng L, Zhu CY, et al. Knockdown of latent transforming growth factor-β (TGF-β)-binding protein 2 (LTBP2) inhibits invasion and tumorigenesis in thyroid carcinoma cells[J]. Oncol Res, 2017, 25(4): 503-510.

[9] Lamar KM, Bogdanovich S, Gardner BB, et al. Overexpression of latent TGFβ binding protein 4 in muscle ameliorates muscular dystrophy through myostatin and TGFβ[J]. PLoS Genet, 2016,12(5):e1006019.

[10] Kretschmer C, Conradi A, Kemmner W, et al. Latent transforming growth factor binding protein 4 (LTBP4) is downregulated in mouse and human DCIS and mammary carcinomas[J]. Cell Oncol, 2011,34(5):419-434.

[11] Chandramouli A, Simundza J, Pinderhughes A, et al. Ltbp1L is focally induced in embryonic mammary mesenchyme, demarcates the ductal luminal lineage and is upregulated during involution[J]. Breast Cancer Res, 2013,15(6):R111.

[12] Serrano-Gomez SJ, Maziveyi M, Alahari SK. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications[J]. Mol Cancer, 2016,15(1):18.

[13] 陳婷婷,于韶榮,曹海霞,等.外泌體在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的促進(jìn)作用研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥, 2016,56(23):106-108.

[14] Munger JS, Sheppard D. Cross talk among TGF-β signaling pathways, integrins, and the extracellular matrix[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2011,3(11):005017.

[15] 周家名,陳莉,王桂蘭,等.沉默EMS1/cortactin 基因?qū)Ω伟〩epG2細(xì)胞遷移、侵襲和細(xì)胞周期的影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2016,36(12):1664-1669.