代文靜，何彬普，孫建，邱靜，馬春蘭，李萬成

(1成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，成都610500；2中國五冶集團有限公司醫(yī)院)

肺纖維化是一種慢性、進行性的間質(zhì)性肺病，發(fā)病機制尚未完全明確，亦缺乏有效的治療方法，患者預(yù)后差[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是肺纖維化形成的關(guān)鍵因子，在肺纖維化的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Smad蛋白是近年發(fā)現(xiàn)的參與TGF-β細胞內(nèi)傳導(dǎo)的一類信號蛋白，是TGF-β受體下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，建立起細胞膜與細胞核之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，TGF-β1通常與Smad蛋白形成信號傳導(dǎo)通路，介導(dǎo)TGF-β1發(fā)揮作用[3,4]。泛素蛋白酶體途徑(UPP)可對細胞內(nèi)蛋白進行特異性降解，是真核細胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng)。Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2(Smurf2)是泛素連接酶E3的一種，可通過泛素化降解Smad7調(diào)控TGF-β1信號傳導(dǎo)，可能參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[5,6]。2016年8月～2017年6月我們進行本研究，探討Smurf2在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1　材料與方法

1.1材料健康清潔級SD雄性大鼠96只，8～10周齡，體質(zhì)量(220±50)g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(川)2015-030。博萊霉素(哈爾濱博萊制藥有限公司)，兔抗大鼠TGF-β1、Smurf2、Smad7單克隆抗體(英國abcam公司)，DMSO溶液、MG132(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Masson染色試劑(北京solarbio科技有限公司)，免疫組化試劑盒(武漢boster生物工程有限公司)。

1.2動物分組及處理將96只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、MG132組和DMSO組，每組24只。各組均采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后暴露氣管，模型組、MG132組、DMSO組制備肺纖維化模型：氣管內(nèi)一次性注入博萊霉素溶液0.3 mL(5 mg/kg)，然后將大鼠直立旋轉(zhuǎn)使藥液在肺內(nèi)均勻分布；對照組一次性注入等量生理鹽水。MG132組每天腹腔注射蛋白酶體抑制劑MG132 0.3 mL(0.1 mg/kg，以DMSO配制)，DMSO組每天腹腔注射等量DMSO，模型組及對照組每天腹腔注射等量生理鹽水。

1.3相關(guān)指標觀察①一般情況：各組于造模后第7、14、28天觀察大鼠精神、食欲、毛色、活動度等一般情況。②肺組織病理學(xué)變化：各組于造模后第7、14、28天分別處死8只大鼠，開胸取出完整肺組織，肉眼觀察肺組織；經(jīng)主支氣管向肺內(nèi)注入10%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋后切片。對切片進行Masson染色，觀察組織病理學(xué)變化；使用ImagePro-Plus6.0圖像分析系統(tǒng)對染色切片進行膠原纖維染色面積測評，以評價肺纖維化程度。肺纖維化程度的判斷標準：輕度：肺纖維化面積占全肺面積<20%；中度：肺纖維化面積占全肺面積的20%～50%；重度：肺纖維化面積占全肺面積>50%。③肺組織TGF-β1、Smurf2、Smad7表達：取各組各時間點肺組織切片，采用免疫組化法檢測TGF-β1、Smurf2、Smad7表達，步驟均參照試劑盒說明書。采用ImagePro-Plus6.0圖像分析系統(tǒng)對免疫組化圖片結(jié)果進行半定量分析，以積分光密度(IOD)值代表表達量。④肺組織Smurf2表達與膠原纖維染色面積、TGF-β1、Smad7表達的關(guān)系：采用Pearson相關(guān)分析法分析肺組織Smurf2表達與膠原纖維染色面積、TGF-β1、Smad7表達的關(guān)系。

2　結(jié)果

2.1各組一般情況比較造模后第7天各組精神、活動等一般情況均良好，組間差異不明顯。造模后第14、28天：對照組一般情況均良好；模型組和DMSO組精神逐漸變差，呼吸逐漸困難，食量減少，體質(zhì)量明顯下降；MG132組精神、食欲、活動度等一般情況均介于對照組與模型組之間。

2.2各組肺組織病理學(xué)變化肉眼觀察，對照組肺組織表面光滑、濕潤，彈性尚可。模型組和DMSO組第7天雙肺表面出現(xiàn)少量暗紅色淤血、出血點，體積無變化；第14、28天雙肺片狀白色區(qū)域逐漸增多，肺體積逐漸縮小，彈性下降，表面凸凹不平。MG132組第7天雙肺表面見少許暗紅色淤血、出血區(qū)域，第14、28天雙肺表面存在淤血、出血區(qū)及色澤蒼白區(qū)，肺體積有所減小，彈性尚可，表面局部凸凹不平。

Masson染色結(jié)果顯示，第7、14、28天對照組肺組織肺泡結(jié)構(gòu)正常，未見明顯藍色膠原沉積。DMSO組及模型組第7天肺泡結(jié)構(gòu)大體正常，少量藍色膠原沉積；第14、28天肺泡結(jié)構(gòu)破壞逐漸嚴重，藍色膠原逐漸增加，較第7天增加明顯。MG132組第7天肺泡結(jié)構(gòu)大體正常，少量藍色膠原沉積；第14、28天肺泡結(jié)構(gòu)少許破壞，藍色膠原略有增加，但較模型組有所減少。第7、14、28天模型組、MG132組和DMSO組肺組織Masson染色面積均逐漸增加，且均高于對照組，MG132組均低于模型組、DMSO組，組間比較P均<0.05。各時間點模型組和DMSO組間比較P均>0.05。見表1。

2.3各組肺組織TGF-β1、Smurf2、Smad7表達第7、14、28天模型組、MG132組和DMSO組肺組織TGF-β1、Smurf2表達的IOD值逐漸增加，且均高于對照組，MG132組均低于模型組、DMSO組，組間比較P均<0.05。第7、14、28天模型組、MG132組和DMSO組肺組織Smad7表達的IOD值逐漸降低，且均低于對照組，MG132組均高于模型組、DMSO組，組間比較P均<0.05。各時間點模型組和DMSO組肺組織TGF-β1、Smurf2、Smad7表達的IOD值比較P均>0.05。見表2。

表1　各組肺組織Masson染色面積比較

表2　　　　各組肺組織TGF-β1、Smurf2、Smad7表達比較

2.4肺組織Smurf2表達與膠原纖維染色面積、TGF-β1、Smad7表達的關(guān)系肺組織Smurf2表達與膠原纖維染色面積及TGF-β1表達均呈正相關(guān)(r分別為0.763、0.623，P均<0.05)，與Smad7表達呈負相關(guān)(r=-0.645，P<0.05)。

3　討論

肺纖維化的病理特征主要為肺泡上皮細胞的炎癥損傷、成纖維細胞過度增殖、細胞外基質(zhì)過度沉積和肺組織異常修復(fù)，最終導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能受損[2,7]。肺纖維化早期病理改變?yōu)榉闻菅?，此后逐漸出現(xiàn)纖維化，造成不可逆性纖維化改變，導(dǎo)致肺功能逐漸下降，甚至呼吸衰竭[7，8]。TGF-β家族主要包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種類型，其中TGF-β1活性最強，功能最多，應(yīng)用最廣泛[9]。TGF-β1是多效性的細胞生長因子，通過促進細胞外基質(zhì)沉積，在肺纖維化疾病的病理變化過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[10～12]。Smad蛋白是近年發(fā)現(xiàn)的參與TGF-β細胞內(nèi)傳導(dǎo)的一類信號蛋白，是TGF-β受體下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，建立起細胞膜與細胞核之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Smad蛋白是TGF-β信號傳導(dǎo)通路中最關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[13,14]。TGF-β1信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮效應(yīng)時大部分需要下游Smad蛋白參與，Smad蛋白是其目的轉(zhuǎn)錄基因的主要信號傳導(dǎo)蛋白，從而建立起胞膜與胞核之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[3]。TGF-β1通過調(diào)控下游的Smad蛋白，誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)各種成分的合成，在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用，是誘導(dǎo)肺纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵細胞因子[12]。

泛素蛋白酶體途徑(UPP)是對細胞內(nèi)蛋白進行特異性降解的主要途徑，是真核細胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，參與細胞凋亡、細胞周期、細胞信號傳導(dǎo)及抗原提呈等多種生理過程，對維持細胞穩(wěn)態(tài)具有重要意義[5,15]。泛素活化過程包括泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3。泛素連接酶E3能促使泛素與特異性蛋白結(jié)合，決定泛素底物蛋白的特異性及高選擇性，Smurf是泛素連接酶E3中的一種，包括Smurf1、Smurf2。Smurf1與Smurf2在蛋白序列及結(jié)構(gòu)上極其相似，但功能上存在許多不同。Smurf1主要參與負調(diào)控骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號傳導(dǎo)，Smurf2主要通過選擇性降解TGF-β1/Smad信號通路中的關(guān)鍵組分，其與受體活化性Smad相比，更易于與抑制性Smad結(jié)合，使Smad7蛋白泛素化降解，進而調(diào)控TGF-β1信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致TGF-β1信號通路異常，促進纖維化的發(fā)生發(fā)展[5,6,16，17]。

MG132是一種醛基肽類蛋白酶體抑制劑，能與蛋白酶體結(jié)合可逆性抑制蛋白酶體活性，從而抑制、阻斷UPP。楊俊俠等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可上調(diào)人肺成纖維細胞中Smurf2表達，而對Smurf1表達無影響。葉燕青等[18]研究發(fā)現(xiàn)，MG132能減輕博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化模型的纖維化程度，但機制不明確。本研究結(jié)果顯示，模型組、DMSO組及MG132組肺組織纖維化程度、Smurf2及TGF-β1表達均逐漸增加，Smad7表達逐漸減少；與模型組及DMSO組相比，MG132組肺纖維化程度減輕，Smurf2及TGF-β1表達下調(diào)，Smad7表達上調(diào)。肺組織Smurf2表達與膠原纖維染色面積、TGF-β1表達呈正相關(guān)，Smurf2與Smad7表達呈負相關(guān)。提示采用MG132抑制Smurf2表達可阻止TGF-β1/Smad7信號傳導(dǎo)，抑制肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，肺纖維化大鼠肺組織中Smurf2表達增加，并通過調(diào)控TGF-β1/Smad7信號傳導(dǎo)促進肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展。Smurf2有可能成為防止肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的一個新靶點。

參考文獻：

[1] Spagnolo P, Rossi G, Cavazza A. Pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis and its clinical implications[J]. Expert Rev Clin Immunol, 2014,10(8):1005-1017.

[2] Overed-Sayer C, Rapley L, Mustelin T, et al. Are mast cells instrumental for fibrotic diseases[J]. Front Pharmacol, 2014,21(4):174.

[3] Zhou Y, He Z, Gao Y, et al. Induced pluripotent stem cells inhibit Bleomycin-Induced pulmonary fibrosis in mice through suppressing TGF-β1/Smad-Mediated epithelial to mesenchymal transition[J]. Front Pharmacol, 2016,15(7):430.

[4] 邱靜,李萬成.特發(fā)性肺纖維化中Smurf2對TGF-β1/Smad通路調(diào)控機制[J].國際呼吸雜志,2016,36(15):1183-1186.

[5] Cai Y, Zhou CH, Fu D, et al. Overexpression of Smad ubiquitin regulatory factor 2 suppresses transforming growth factor-βmediated liver fibrosis[J]. J Dig Dis, 2012,13(6):327-334.

[6] 駱菁怡,張立婷,魯明霞,等.Smurf2對肝纖維化中TGF-β/Smad通路的影響[J].醫(yī)學(xué)綜述,2015,21(17):3113-3116.

[7] Wang C, Gu S, Cao H, et al. miR-877-3p targets Smad7 and is associated with myofibroblast differentiation and bleomycin-induced lung fibrosis[J]. Sci Rep, 2016(6):30122.

[8] Rafii R, Juarez MM, Albertson TE, et al. A review of current and novel therapies for idiopathic pulmonary fibrosis[J]. J Thoracic Dis, 2013,5(1):48-73.

[9] Verrecchia F, Mauviel A. Transforming growth factor-beta and fibrosis[J]. World J Gastroenterol, 2007,13(22):3056-3062.

[10] Piera-Velazquez S, Jimenez SA. Molecular mechanisms of endothelial to mesenchymal cell transition (EndoMT) in experimentally induced fibrotic diseases[J]. Fibrogenesis Tissue Repair, 2012,5(Suppl 1):S7.

[11] 楊俊俠,曹述任,張敏.Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2在轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)人肺成纖維細胞活化中的作用及其分子機制[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2015,41(5):891-897.

[12] Bhattacharyya S, Wei J, Varga J. Understanding fibrosis in systemic sclerosis: shifting paradigms, emerging opportunities[J]. Nat Rev Rheumatol, 2011,8(1):42-54.

[13] Attisano L, Wrana JL, Signal transduction by the TGF-β superfamily[J]. Science, 2012,296 (5573):1646-1648

[14] Budi EH, Xu J, Derynck R. Regulation of TGF-β Receptors[J]. Methods Mol Biol, 2016,13(44):1-33.

[15] Liu FY, Li XZ, Peng YM, et al. Arkadia-Smad7-mediated positive regulation of TGF-β signaling in a rat model of tubulointerstitial fibrosis[J]. Am J Nephrol, 2007,27(2):176-83.

[16] Wu B, Guo B, Kang J, et al. Downregulation of Smurf2 ubiquitin ligase in pancreatic cancer cells reversed TGF-β-induced tumor formation[J].Tumour Biol, 2016(11):1-15.

[17] Ganji A, Mosayebzadeh H, Varasteh A, et al. The effects of WW2/WW3 domains of Smurf2 molecule on TGF-β signaling and arginase I gene expression[J]. Cell Biol Int, 2015,39(6):690-695.

[18] 葉燕青,張細曼.泛素-蛋白酶體抑制劑對大鼠肺纖維化的影響[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2013,33(3):196-198.