薛亞軍，耿濤，黃冰，羅波，魏育濤

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000)

小細胞肺癌(SCLC)具有高度侵襲性，早期即可通過血液循環(huán)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移至多個臟器，其易發(fā)生轉(zhuǎn)移的確切機制目前仍不清楚。miRNAs是一組長度為20～22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過與靶基因的3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)結(jié)合調(diào)控基因表達[1]。目前在人體中已發(fā)現(xiàn)1 880多個miRNAs，約30%的人類蛋白編碼基因受miRNAs調(diào)控[2]。異常表達的miRNAs與人類多種腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，位于靶基因3′-UTR中的單核苷酸可調(diào)控miRNAs與靶基因的結(jié)合，進而調(diào)控SCLC的發(fā)生、發(fā)展[4]；miRNAs在血漿或血清中的穩(wěn)定性良好，能對抗RNA酶降解[5]，有望成為早期SCLC診斷、治療及患者預(yù)后判斷的理想非侵入性生物標志物?；蛐酒且环N快速有效檢測miRNAs表達譜的技術(shù)。2015年4月～2016年12月，我們利用基因芯片技術(shù)篩選廣泛期與局限期SCLC間差異表達miRNAs，現(xiàn)分析結(jié)果，探討SCLC轉(zhuǎn)移過程中整個基因組及信號通路的變化。

1　材料與方法

1.1基因表達數(shù)據(jù)在高通量基因表達數(shù)據(jù)庫(GEO)檢索框中以“small cell lung cancer”和“metastasis”為檢索詞，獲得GSE67804芯片數(shù)據(jù)。GSE67804所用的實驗平臺為Illumina公司的Agilent-038166 cbc_human_miR18.0芯片。采用6例SCLC患者的血清樣本，其中3例為廣泛期SCLC(ED組)，3例為局限期SCLC(LD組)。登錄號GSM1656377～GSM1656379為ED組樣本，登錄號GSM1656380～GSM1656382為LD組樣本。

1.2數(shù)據(jù)過濾、標準化及差異miRNAs篩選將GEO中下載的數(shù)據(jù)集導(dǎo)入Qlucore Omics Explorer3.0軟件；對數(shù)據(jù)信息進行標準化處理(平均數(shù)為0，標準差為1)，兩組樣本間比較采用t檢驗，對數(shù)據(jù)信息進行有效過濾。篩選出差異miRNAs，差異miRNAs的篩選條件為P<0.05，差異倍數(shù) |Fold change|≥2。

1.3差異基因的GO富集分析和通路分析利用TargetScan、miRDB、miRTarBase對差異miRNAs進行綜合靶基因預(yù)測，取至少2個以上軟件預(yù)測得到的基因作為靶基因。將篩選出的差異基因輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/home. jsp)進行GO分析及KEGG信號通路分析，通過Fisher Exact Test計算P值，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4差異基因的STRING蛋白相互作用分析將差異基因?qū)隨tring10.0在線分析網(wǎng)站http://string-db.org/)，將最低互作分值設(shè)置成高度可信(high confidence: 0.7)，進行靶基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。

2　結(jié)果

2.1兩組血清中差異miRNAs篩選ED組與LD組共篩選出17個差異miRNAs(P<0.05，|Fold change|≥2)，預(yù)測出1 421個靶基因。

2.2差異miRNAs靶基因的GO分析ED組較LD組差異miRNAs所對應(yīng)的靶基因共參與24項顯著性功能，包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，DNA模板轉(zhuǎn)錄及信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程(BP)，蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性及序列特異性DNA結(jié)合等分子功能(MF)，核質(zhì)、細胞質(zhì)及高爾基體等細胞組件(CC)。見表1。

2.3差異miRNAs靶基因參與的KEGG富集分析ED組與LD組差異miRNAs所對應(yīng)的靶基因共參與19條顯著性信號通路，包括惡性腫瘤通路、胞吞作用、Ras信號通路、膽堿代謝、Rap1信號通路、調(diào)節(jié)干細胞多能性信號通路、SCLC、FoxO信號通路、mRNA監(jiān)視通路、PI3K-Akt信號通路、cAMP信號通路以及ErbB信號通路等。見圖1。

圖1　差異表達miRNAs靶基因的KEGG富集分析

2.4靶基因編碼蛋白間的相互作用通過靶基因的GO和KEGG pathway分析，得到顯著性GO和顯著性信號通路及其所屬的靶基因，取顯著性GO的靶基因和顯著性信號通路的靶基因交集，將這些靶基因集合匯總后通過STRING10.0在線分析軟件(http://string-db.org/)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示，在差異miRNAs靶基因編碼蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，靶基因信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3)、SMAD3、E2F1、基質(zhì)金屬蛋白2(MMP2)、SP1、雄激素受體(AR)、胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)、核因子κB1(NFκB1)、蛋白激酶2(AKT2)編碼蛋白在網(wǎng)絡(luò)中具有核心地位。

3　討論

SCLC轉(zhuǎn)移是多基因參與并調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過程，分子間相互作用的調(diào)節(jié)在SCLC轉(zhuǎn)移形成中的具體作用及作用機制尚未明確。因此，結(jié)合基因芯片表達數(shù)據(jù)的挖掘及生物信息學(xué)分析，從分子水平揭示SCLC轉(zhuǎn)移的本質(zhì)，研究SCLC轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，可為更好地理解SCLC轉(zhuǎn)移進展、惡化機制提供有益的向?qū)跃€索。研究證實，miRNAs可作為腫瘤的促進因子調(diào)控細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等[6]，并參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等整個過程[7]。本研究利用Qlucore Omics Explorer3.0軟件對芯片數(shù)據(jù)進行挖掘共篩選出17個差異miRNAs；差異miRNAs所預(yù)測靶基因的GO和KEGG富集分析結(jié)果中，GO富集結(jié)果提示這些miRNAs可能通過調(diào)控腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及激活、細胞連接以及細胞內(nèi)受體信號通路等影響癌細胞的轉(zhuǎn)移。KEGG結(jié)果顯示，差異表達miRNAs的靶基因顯著富集于胞吞作用、Ras信號通路、Rap1信號通路、PI3K-Akt信號通路以及局部黏附通路等腫瘤相關(guān)信號通路。研究表明，在胞吞通路中關(guān)鍵蛋白發(fā)生功能紊亂可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，如銜接蛋白Epsins在肺癌中高表達，可以促進腫瘤細胞的侵襲[8]。Ras信號通路與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。McCubrey等[9]在結(jié)腸癌、卵巢癌、黑素瘤等腫瘤中發(fā)現(xiàn)了Ras突變。在Rap1信號通路中，Rap1b也可在多種腫瘤中表達上調(diào)，激活Rap1b，促進血管生成、內(nèi)皮細胞遷移及增殖，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。PI3K-AKT 通路可通過MMPs活化誘導(dǎo)腫瘤細胞的侵襲，增加細胞的轉(zhuǎn)移能力[11]。Akca 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT通路的活化可導(dǎo)致肺癌細胞的侵襲能力增強。局部黏附通路能夠影響細胞的增殖、黏附，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[13]。這些結(jié)果說明胞吞作用、Ras通路、Rap1通路、PI3K-Akt通路及局部黏附通路等信號通路異?？赡苁荢CLC轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。而這些通路彼此之間是否會互相影響，也值得深入研究。

表1　差異miRNAs靶基因的GO富集分析

注：E(代表指數(shù))表示將前面的數(shù)字乘以10的n次冪。例:2.33E-08=2.33×10-8=0.000 000 023 3。

STRING蛋白互作分析結(jié)果顯示，差異miRNAs主要調(diào)控STAT3、SMAD3、E2F1、MMP2、SP1、AR、IGF1R、NFKB1、AKT2等關(guān)鍵靶蛋白表達。STAT3與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]，STAT3激活可促進SMAD3表達，增加肺癌細胞遷移和侵入[15]。在95%的SCLC組織中E2F1表達升高，參與細胞黏附、細胞遷移、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移，并在轉(zhuǎn)錄后激活SP1和NF-κB[16]，通過調(diào)控MMPs表達發(fā)揮促侵襲轉(zhuǎn)移作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，MMPs家族的MMP2對肺癌侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有促進作用[18]；SP1可通過調(diào)控腫瘤相關(guān)基因E2F1、MMP2表達而影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[19]；胰島素樣生長因子(IGF)和胰島素樣生長因子受體(IGFR)在SCLC中均呈高表達[20]；AR在肺癌中的表達提示患者預(yù)后可能更差[21]；AKT2在促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要功能[22]，并可通過促進IGF1R表達使胰腺癌細胞運動增加[23]。上述研究中的蛋白與我們通過STRING預(yù)測處于核心地位的靶蛋白相吻合，提示這些靶蛋白很可能是SCLC轉(zhuǎn)移相關(guān)調(diào)控途徑的關(guān)鍵蛋白。

綜上所述，本研究通過對SCLC轉(zhuǎn)移相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)GSE67804的挖掘，篩選出17個差異表達miRNAs，它們通過調(diào)控胞吞作用、Ras通路、Rap1通路、PI3K-AKT通路、局部黏附通路以及STAT3、SMAD3、E2F1、MMP2、SP1、AR、IGF1R、NFKB1和AKT2等蛋白表達在SCLC廣泛轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。上述差異表達miRNAs為SCLC廣泛轉(zhuǎn)移的早期診斷和治療提供了可能的生物標志物，并且為研究SCLC廣泛轉(zhuǎn)移發(fā)生的分子機制遴選出重要的信號通路及關(guān)鍵蛋白。

參考文獻：

[1] Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, et al. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs[J]. Science, 2001,294(5543):853-858.

[2] Kozomara A, Griffiths-Jones S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data[J]. Nucl Acids Res, 2011,39(suppl 1):D152-D157.

[3] Le XF, Merchant O, Bast RC, et al. The roles of microRNAs in the cancer invasion-metastasis cascade[J]. Cancer Microenviron, 2010,3(1):137-147.

[4] Rothschild SI. Epigenetic therapy in Lung Cancer-Role of microRNAs[J]. Front Oncol, 2013,3(1):158.

[5] Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancerdetection[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008,105(30):10513-10518.

[6] Li CG, Pu MF, Li CZ, et al. MicroRNA-1304 suppresses human non-small cell lung cancer cell growth in vitro by targeting heme oxygenase-1[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 2017,38(1):110-119.

[7] Chen X, Hu Z, Wang W, et al. Identification of ten serum microRNAs from a genome-wide serum microRNA expression profile as novel noninvasive biomarkers for non small cell lung cancer diagnosis[J]. Int J Cancer, 2012,130(7):1620-1628.

[8] Coon BG, DiRenzo DM, Konieczny SF, et al. Epsins′ novel role in cancer cell invasion[J]. Commun Integr Biol, 2011,4(1):95-97.

[9] McCubrey JA, Steelman LS, Chappell WH, et al. Roles of the Raf /MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance[J]. Biochim Biophys Acta, 2007,1773(8):1263-1284.

[10] Chrzanowska-Wodnicka M, Kraus AE, Gale D, et al. Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice[J]. Blood, 2008,111(5):2647-2656.

[11] Zhang S, Xiao J, Chai Y. et al. Speckle-type POZ protein down-regulates matrix metalloproteinase 2 expression via Sp1/PI3K/Akt signaling pathway in colorectal cancer[J]. Dig Dis Sci, 2018,63(1):395.

[12] Akca H, Demiray A, Tokgun O, et al. Invasiveness and anchorage independent growth ability augmented by PTEN inactivation through the PI3K/AKT/NFkB pathway in lung cancer cells[J]. Lung Cancer, 2011,73(3):302-309.

[13] Saidel M, Dos Santos KC, Nagano LFP, et al. Novel anti-prostate cancer scaffold identified by the combination of in silico and cell-based assaystargeting the PI3K-AKT-mTOR pathway[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2017,27(17):4001-4006.

[14] De Via F, Vecchione L, Galizia G, et al. Perspectivesin in adjuvant therapy of gastric cancer[J]. Oncology, 2009,77(Suppl 1):38-42.

[15] Liu RY, Zeng Y, Lei Z, et al. JAK/STAT3 signaling is required for TGF-β induced epithelial-mesenchymal transition in lung cancer cells[J]. Int J Oncol, 2014,44(5):1643-1651.

[16] Li Z, Guo Y, Jiang H, et al. Differential regulation of MMPs by E2F1, Sp1 and NF-kappa B controls the small cell lung cancer invasive phenotype[J]. BMC Cancer, 2014,14(1):276.

[17] Li ZL, Jiao F, Ma Y, et al. Target genes regulated by transcription factor E2F1 in small cell lung cancer[J]. Acta Physiologica Sinica, 2016,68(3):276-284.

[18] 王鳳云,張艷橋,羅明,等.p-Stat3、VEGF-C和MMP-2在非小細胞肺癌中的表達及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].癌變·畸變·突變,2011,23(2):107-110,122.

[19] 黃晶,陳靜,曹如波,等.轉(zhuǎn)錄因子Sp1在非小細胞肺癌組織中的表達及其意義[J].腫瘤防治研究,2013,40(3):290-292.

[20] Socinski MA, Weissman C, Hart LL, et al. Randomized phase Ⅱ trial of pemetrexed combined with either cisplatin or carboplatin in untreated extensive-stage small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2006,24(30):4840-4847.

[21] 劉先本,王淑玲,閆明,等.雄激素和雌激素受體在肺腺癌和肺鱗癌中的表達[J].江蘇醫(yī)藥,2010,36(9):1000-1002.

[22] Toker A. Achieving specificity in Akt signaling in cancer[J]. Adv Biol Regul, 2012,52(1):78-87.

[23] Banno E, Togashi Y, de Velasco MA, et al. Clinical significance of Akt2 in advanced pancreatic cancer treated with erlotinib.[J]. Int J Oncol, 2017,50(6):2049-2058.